纳豆激酶(Nattokinase, NK)又名枯草杆菌蛋白酶NAT(subtilisin NAT),最早于1987年被日本学者Sumi等人从纳豆中分离得到。在日本,纳豆是传统且受欢迎的大豆发酵食品,它的历史可追溯到2000多年以前。在民间,纳豆被传统地用作心脏和血管疾病的用药,同时,纳豆也被用作缓解疲劳和抗脚气病的药物。NK是在纳豆发酵过程中由食品级微生物纳豆枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶,属于枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶。NK在体内和体外都具有很强的纤溶活性,它的纤溶活力是纤溶酶的4倍。NK不仅能直接降解纤维蛋白,还能提高血浆中组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的量,从而导致纤溶酶原转变成具有活性的纤溶酶,提高体内纤溶酶的量与作用。此外,NK还可以通过切割失活t-PA的抑制剂PAI-1而提高纤溶活性。对NK溶解血栓的研究表明NK是一个可口服降解血栓的潜在自然用药。相比传统溶血栓药物,NK具有安全性好,可口服,成本低,强纤溶活力和药效长等特点,具有被开发成为功能性食品添加剂和预防或治疗心脑血管疾病药物的潜能。因此,利用蛋白质工程技术对NK分子进行改造,提高其酶活力和稳定性为拓展NK在医药和商业领域的应用起着非常重要的作用。在本研究中,我们首先采用分子生物学和生物化学等方法探究了NK成熟肽基因aprN (MP)和NK全肽基因aprN在Escherichia Coli (E.coli) BL21中的表达,研究了NK信号肽和前导肽对NK在E.coli BL21中表达成熟的影响；采用重叠延伸PCR方法将活性位点221位的Ser分别突变为Cys和Ala,探究了酶自身活性对NK在E.coli BL21中表达成熟的影响。结果显示,NK在E.coli BL21中的表达成熟不仅需要信号肽和前导肽的帮助,同时也需要酶自身活性的帮助。采用重叠延伸PCR方法对NK的31位氨基酸残基进行定点突变,将此位点的Ile突变成为Leu,采用Ni柱亲和层析和DEAE阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,采用传统光谱法(四肽底物法)和等温滴定量热法(ITC)两种方法对NK的酶促反应动力学常数进行了测定；同时,也采用纤维蛋白平板法测定了酶的纤溶活力。结果显示,传统光谱法(四肽底物法)与等温滴定量热法(ITC)测NK动力学常数显示出良好的一致性,且均表明突变体I31L的催化效率较野生型NK提高了2倍多。纤维蛋白平板法测NK纤溶活力的结果也显示突变体I31L的酶活力较野生型NK提高了约2倍。此外,对野生型NK和突变体I31L进行计算机分子动力学模拟,结果显示,相比于野生型NK,在突变体I31L中,31位氨基酸残基的突变使得Asp32侧链氧原子与His64咪唑环上的氮原子(ND1)之间的空间距离变得更小,这导致Asp32侧链的2个氧原子形成的负电中心对His64咪唑环的推电子效应增强,即使得His64咪唑环间位的氮原子(NE2)的负电性增强,导致His64夺取Ser221羟基质子的能力增强,从而间接导致了Ser221的亲核攻击能力增强,即使突变体I31L具有更强的催化能力。采用重叠延伸PCR方法构建了4个突变体NK(T220S, M222A, T220S/I31L和M222A/I31L),采用Ni柱亲和层析和DEAE阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,采用丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting方法鉴定目的蛋白,采用四肽底物法测定酶的动力学常数,采用纤维蛋白平板法测定酶的纤溶活力,采用荧光光谱法和圆二色谱法检测突变对蛋白结构的影响。结果显示,2个单点突变体NK(T220S和M222A)的氧化稳定性较野生型NK均有较大提高。然而,这2个突变体NK的酶活力较野生型NK也有不同程度的下降,尽管突变体T220S的酶活力下降较小。后2个双点突变体NK(T220S/I31L和M222A/I31L)因为引入工31L这个突变,酶活力较单点突变体NK(T220S和M222A)均有提高。其中双突变体M222A/I31L的抗氧化活性较野生型NK高且与单点突变体M222A相当。然而,双突变体T220S/I31L的抗氧化活性较单点突变体T220S有明显下降且在1.0M H2O2处理的情况下与野生型NK相当。此外,荧光光谱和圆二色谱检测突变对蛋白结构影响的结果显示,突变对酶的结构没有明显影响。对野生型NK和突变体T220S进行分子动力学模拟的结果显示,突变体T220S中的Ser220和野生型NK中的Thr220一样,均能与Asn155形成氢键。另外,在突变体T220S中,222位的Met空间结构因220位的Thr突变为Ser而发生了明显的改变,这可能使222位的Met更不容易与外界的氧化剂相接触,避免了被氧化失活,从而导致突变体T220S的抗氧化活性较野生型NK也有所提高。采用重叠延伸PCR方法在酶分子中引入2个Cys以研究二硫键对NK热稳定性的影响,构建了3个双突变体NK(G61C/S98C,T22C/S87C和S24C/S87C)。采用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定目的蛋白并检测分子内二硫键,采用生物化学方法测定酶的热稳定性。结果显示,3个突变体NK分子中的2个Cys之间均没有形成二硫键,酶的热稳定性也没有因突变而获得提高。此外,热稳定性的测定结果也表明,在相同温度条件下,NK在Ca2+存在的条件下,其热稳定性比在EDTA存在的条件下强,但当温度达到62℃时,酶即使在Ca2+存在的条件下也会迅速变性失活。