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第一部分干扰β-catenin抑制人胶质瘤细胞U251增殖目的:研究干扰β-catenin的表达是否能够抑制人胶质瘤细胞U251的增殖能力。方法:1采用RNA干扰技术干扰胶质瘤细胞U251细胞中β-catenin的表达。将U251细胞分出4个处理组,且各处理组分别转染N.C.siRNA,siRNAl,siRNA2,siRNA3。然后再用WB和RT-PCR技术来检测β-catenin的表达水平。2将U251细胞分为对照组,N.C.siRNA组,siRNA2组,其中对照组添加转染试剂,而N.C.siRNA组和siRNA2组则分别转染N.C.siRNA和siRNA2。然后再用RT-PCR来检测细胞增殖相关基因(cyclinD1,c-Myc,c-jun)的表达水平。3采用MTT法检测U251细胞活力。4采用划痕实验来检测U251细胞的迁移能力。结果:1与对照组N.C.siRNA相比,转染siRNAl和siRNA 2均可显著的降低U251细胞β-catenin的蛋白水平和mRNA水平,而siRNA3则没有什么效果,且三者之间siRNA2的干扰效果最好。2与对照组相比,siRNA2干扰β-catenin的表达可显著的降低U251细胞的活力,下调与U251细胞增殖相关基因(cyclinD1和c-Myc)的mRNA表达。3 siRNA2干扰β-catenin的表达可显著的降低划痕之间的距离,表明可抑制U251细胞的迁移与侵袭能力。结论:干扰β-catenin的表达可显著的降低U251细胞的增殖和迁移能力。第二部分干扰β-catenin促进人胶质瘤细胞U251凋亡目的:研究干扰β-catenin的表达是否能够促进人胶质瘤细胞U251的凋亡。方法:1将U251细胞分成对照组,N.C.siRNA组和siRNA2组,其中对照组中添加转染试剂,而N.C.siRNA组和siRNA2组则分别转染N.C.siRNA和siRNA2。2通过采用细胞流式术检测siRNA2干扰后U251细胞的凋亡情况。3用RT-PCR和WB来检测凋亡相关基因的表达。结果:1细胞流式结果表明,与对照组和N.C.siRNA组相比,siRNA2干扰β-catenin的表达可显著的促进U251细胞的凋亡。2 siRNA2干扰β-catenin的表达也可显著的增加促凋亡基因(p53,caspase3,caspase9,Bax)的表达,而下调抗凋亡基因Bcl-2的表达。3 WB结果也表明,siRNA2干扰β-catenin的表达显著的增加了cleaved-caspase3 的表达水平。结论:siRNA2干扰β-catenin的表达可显著的促进U251细胞的凋亡。第三部分干扰β-catenin对人胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的作用机制目的:研究干扰β-catenin对人胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的作用机制方法:1将U251细胞分成对照组,N.C.siRNA组和siRNA2组,其中对照组中添加RNA转染试剂,而N.C.siRNA组和siRNA2组则分别转染N.C.siRNA和siRNA2。2 用WB 检测干扰 β-catenin 的表达对 U251 中 PI3K,p-Akt,JNK,p-JNK,IKKa/β,p-IKKa/β以及核内NF-kB蛋白水平的影响。3用PDTC抑制NF-kB信号通路,再用WB检测核内的NF-kB蛋白水平,用MTT检测U251细胞活力,以及RT-PCR检测凋亡相关基因的表达。结果:1与对照组和N.C.siRNA组相比,siRNA2干扰β-catenin的表达对U251细胞中PI3K,p-Akt,JNK,p-JNK的蛋白水平均没有显著的影响。然而,siRNA2干扰β-catenin的表达则可显著的增加了 U251细胞中总IKKa/β,磷酸化的p-IKKa/β以及核内的NF-kB的蛋白水平。2 PDTC处理可显著的降低U251细胞中核内NF-kB的蛋白水平,表明有效的抑制干扰β-catenin介导的NF-1kB信号通路的活化。3 MTT结果显示PDTC处理后明显的恢复干扰β-catenin介导的U251细胞活力抑制和凋亡基因的表达。结论:干扰β-catenin的表达介导的U251细胞增殖抑制和凋亡可能是由NF-1kB信号通路来实现的,而不依赖于PI3K-Akt和JNK信号通路。第四部分干扰β-catenin抑制裸鼠胶质瘤的形成目的:通过构建siRNA2慢性病毒质粒转染的U251细胞,然后采用皮下注射方法来研究干扰β-catenin的表达是否能够体外抑制胶质瘤的形成。方法:1将U251细胞分成对照组,N.C.siRNA组和siRNA2组,其中对照组中添加质粒转染试剂,而N.C.siRNA组和siRNA2组则分别转染N.C.siRNA和siRNA2的慢性病毒质粒。2将用WB和RT-PCR来检测β-catenin的表达,确实siRNA2质粒是否转染成功。3将裸鼠分成对照组,N.C.siRNA组和siRNA2组,其中对照组皮下注射正常的U251细胞,而N.C.siRNA组和siRNA2组则分别皮下注射N.C.siRNA组和siRNA2质粒转染的U251细胞,然后统计裸鼠的成活率以及用RT-PCR检测肿瘤组织凋亡相关基因的表达。结果:1 WB和RT-PCR结果均表明,siRNA2质粒转染后可显著的降低β-catenin的蛋白和mRNA水平,表明siRNA2质粒转染成功。2裸鼠成瘤实验表明,siRNA2干扰g-catenin的表达可显著的增加裸鼠的成活率,同时也可增加促凋亡基因(caspase3,Bax)的表达,反而降低抗凋亡基因Bcl-2的表达。结论:干扰β-catenin的表达可显著的增加成瘤裸鼠的成活率,促进凋亡相关基因的表达,表明可以显著的抑制胶质瘤的形成。