纳米金探针液相杂交法检测核酸序列依赖扩增产物诊断侵袭性曲霉病

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目的:建立纳米金探针液相杂交的方法检测核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)产物,用于快速诊断侵袭性曲霉病。并结合GM试验进行评价,从而确立侵袭性曲霉病的最佳实验室诊断策略。方法:设计针对曲霉菌18S rRNA保守序列的寡核苷酸探针,5’端进行巯基化俢饰,将探针组装到直径为60nm的金颗粒表面制成纳米金探针。采用NASBA方法将曲霉菌属和非曲霉菌属的细菌及真菌18S rRNA作为靶目标进行扩增,扩增后的产物与纳米金探针进行液相杂交,观察反应体系颜色变化或其在反向色谱盘上颗粒凝集情况,考察NASBA和纳米金探针检测的特异度。根据欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组(EORTC/MSG)诊断侵袭性曲霉病的分级标准,收集106例临床标本(14例确诊,32例拟诊,60例未感染IA)采用NASBA-纳米金探针方法进行检测,并与GM试验结果进行比较以评价该方法的准确性。最后分别对两种方案进行联合诊断,并对其效能指标进行评价,确定IA实验室诊断的最佳方案。结果:纳米金探针只与曲霉菌属菌株的NASBA产物出现阳性杂交反应,反应体系颜色由酒红色变为灰蓝色,反向色谱盘检测出现黑色凝集颗粒,而其他非曲霉菌均为阴性。NASBA-纳米金液相杂交法检测106例临床标本的敏感性和特异性分别为82.61%(38/46)、81.67%(49/60)。ROC曲线下面积(AUCROC)为0.890。GM试验检测的敏感性和特异性分别为56.52%(26/46)和83.33%(50/60),ROC曲线下面积(AUCROC)为0.723。在联合诊断时,NASBA-纳米金探针法与GM试验串联方案具有最高的特异度(100%)和阳性预测值(100%);NASBA-纳米金探针法和GM试验并联方案则有最好的灵敏度(89.13%)和阴性预计值(88.89%)。结论:NASBA-纳米金液相杂交技术检测曲霉菌具有敏感性高、特异性强、操作简单的特点,适合实验室常规开展。同时联合诊断策略在特定情况下能够提高诊断效能和临床早期诊断IA的准确性。
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