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抗体,是由浆细胞分泌的能够识别外来抗原物质的糖蛋白,是免疫系统中的一种重要组成部分。抗体的研究为疾病诊断及治疗多种疾病如肿瘤、自身免疫疾病等开拓了广阔的前景,同时抗体研究也在重大疾病预防、控制中起到了重要作用。正是由于抗体类疫苗的研发使得狂犬病等多种高危性疾病得到了有效的控制[1]。目前的研究已经表明:在IgG抗体重链可结晶片段(Fragment crystallizable,Fc)297位存在保守的N-糖基化修饰Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)基序,在天冬酰胺上存在有N-糖基化修饰。连接在保守Asn基序上的N-糖基化修饰对Fc片段与受体结合有重要作用,更对抗体效应的发挥如细胞与抗体间识别、调节作用等生理生化反应起着重要的作用。现有的研究表明异常的糖基化修饰与某些自身免疫病有直接的联系。这些研究提示糖基化修饰在抗体Fc片段的生物学效应中起到关键性作用。我们之前的研究发现一株针对软骨寡聚基质蛋白(COMP)的鼠源特异性单克隆抗体15A11,该抗体表现出极强的诱导实验动物关节炎的活性。然而,15A11抗体的Fc片段糖基化情况及糖基化对免疫细胞的刺激作用产生的影响尚不明确。本研究中,我们利用不同N-聚糖分离与分析方法检测15A11的N-糖基化修饰特征,之后检测了15A11抗体与其靶蛋白COMP结合情况,及15A11抗体形成的免疫复合体对巨噬细胞活化、分化情况、吞噬能力及细胞因子(TNF-α、IL-1)分泌水平的影响。研究结果如下:(1)通过液相色谱串联高分辨质谱方法检测了15A11单抗重链恒定区序列以及糖基化位点情况。进一步分析15A11糖基化情况,结果显示15A11样品中检测到24种糖型的存在。针对糖肽的LC-ESI-MS/MS、针对糖链的MALDI-TOF-MS、LC-ESI-MS/MS都显示N-糖链的主要修饰类型为岩藻糖化修饰。复杂型糖型占大多数,很难检测到高甘露糖型的存在。15A11存在的糖基化修饰体现出了鼠源性抗体的物种特异性。(2)免疫组化实验结果显示15A11单抗与关节软骨特异结合能力与16B5、M2139单抗相比,无显著差异。而在关节切片与腹腔渗出巨噬细胞共孵育之后,显微镜下观察可见经15A11免疫复合体刺激的巨噬细胞产生明显的形态变化,关节组织产生明显的疏松趋势,关节孔洞直径显著增加,而16B5、M2139免疫复合体物刺激下的巨噬细胞未产生明显变化。结果显示15A11与COMP蛋白的特异结合使得15A11免疫复合体刺激腹腔渗出巨噬细胞使其活化并对关节组织产生损伤。说明15A11-抗原复合物具备强烈的活化巨噬细胞作用。(3)巨噬细胞吞噬实验结果显示15A11免疫复合体刺激腹腔渗出巨噬细胞,细胞形态变化,呈现典型的巨噬细胞的形态,细胞体积变大,伸出伪足。且15A11免疫复合体能诱导巨噬细胞产生显著增强的吞噬作用,巨噬细胞的吞噬指数和吞噬率均有显著提升。而经去糖基化的免疫复合体后刺激后吞噬作用没有显著提升,提示糖基化修饰与这种刺激作用有关联。(4)巨噬细胞向M1分化的重要标志为CD86、F4/80。流式细胞术分析结果显示15A11、16B5免疫复合体刺激巨噬细胞细胞后表达CD86+F4/80+的细胞所占比例分别为22.3%、18.2%,而去糖基化后双阳性比例分别为11.4%、12.5%。结果显示15A11免疫复合体刺激效果最佳,但去糖基化后的免疫复合体不产生显著刺激作用。结果说明15A11免疫复合体刺激巨噬细胞引发巨噬细胞向M1分型分化,而糖基化修饰与这种刺激作用有关联。(5)酶联免疫吸附试验结果显示15A11免疫复合体较之16B5免疫复合体,会使得巨噬细胞产生更强的吞噬作用和更高的细胞因子分泌水平。糖链去除后,我们未发现15A11免疫复合体对巨噬细胞产生了明显的刺激作用。结果提示着15A11免疫复合体的刺激作用与其N-糖链有关。本研究阐明了 15A11单克隆抗体显著强于同型抗体16B5及阳性对照M2139抗体刺激巨噬细胞能力主要不是来自于15A11抗体的Fab片段,而是来自于15A11抗体Fc片段与效应细胞FcR结合后产生的特殊作用。这种作用极可能是来自于15A11抗体Fc片段的特殊糖基化修饰情况。15A11单克隆抗体Fc片段的糖基化修饰存在岩藻糖、半乳糖修饰的特异性,这种糖基化修饰对抗体活性造成影响。