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第一部分慢性神经痛大鼠脊髓星形胶质细胞缝隙连接蛋白43的表达
目的:通过坐骨神经结扎损伤(CCI)模型研究慢性神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(Connexin43，Cx43)表达的变化。
方法:3～4周龄SD大鼠38只随机分配到两组，分别接受右坐骨神经结扎手术(CCI组)和假手术(Sham组，暴露分离坐骨神经，但未行结扎)。手术前1d以及手术后1d，3d，5d，7d，14d(分别记为d0、d1、d3、d5、d7、d14)，观察大鼠疼痛行为学变化并测定后肢热刺激回缩潜伏期(PWTL)、电刺激回缩阈值(PWET)的变化；于d14取大鼠L45右侧脊髓采用免疫组化分析Cx43和胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidprotein，GFAP)表达的变化，并以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照基因，采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)半定量分析CCI组和Sham组大鼠L4-5脊髓Cx43、GFAPmRNA表达的差异。
结果:手术后第7天，Sham组大鼠行走步态恢复正常，而CCI组大鼠术后一直表现为跛行、不能负重等行走步态异常。与d0比较，CCI组术后右后肢PWTL、PWET明显降低(P＜0.01)，Sham组d1、d3、d5轻度降低，d7后恢复至术前基础水平(P＞0.05)；组间同时点比较CCI组降低程度明显大于Sham组。观察期内，两组大鼠手术前后左后肢PWTL、PWET无明显改变。术后d14免疫组化显示CCI组脊髓背角星形胶质细胞与Sham组相比呈现为明显活化状态，胞体大，突起多而粗大。CCI组和Sham组L4-5脊髓右侧背角GFAP阳性染色面积分别占(29±7)％和(19±5)％(P＜0.01)；Cx43阳性染色面积分别占(17±3)％和(4±1)％(P＜0.01)；CCI组阳性染色增多主要集中在脊髓Ⅰ～Ⅲ层。Sham组脊髓L4-5Cx43扩增产物量极少，而CCI组Cx43扩增产物量约为Sham组3.0倍；CCI组GFAP扩增产物量约为Sham组的1.35倍。
结论:慢性神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞Cx43蛋白及mRNA表达增加，其中脊髓背角浅层Cx43蛋白表达增加最为显著，且Cx43与GFAP表达变化相一致，提示星形胶质细胞缝隙连接可能在神经痛的形成和维持中起重要作用。
第二部分鞘内注射MK-801对慢性神经痛大鼠的治疗作用及对脊髓星形胶质细胞Cx43表达的影响
目的:观察鞘内注射NMDA受体拮抗剂MK-801对大鼠坐骨神经结扎损伤(CCI)慢性神经痛的治疗效应，并观察其对脊髓星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)表达的影响。
方法:3周龄SD雄性大鼠24只随机分为3组(n=8)，分别为组Ⅰ：假手术(分离暴露坐骨神经，不行坐骨神经结扎)大鼠，鞘内注射生理盐水(NS)；组Ⅱ：CCI慢性疼痛模型大鼠，鞘内注射MK-801(10μg)；组Ⅲ：CCI慢性疼痛模型大鼠，鞘内注射NS。从坐骨神经结扎手术(或假手术)当天开始，连续15天，每24h鞘内注射MK-801或NS一次。手术前以及手术后第7d、14d测定后肢热刺激回缩潜伏期(PWTL)、电刺激回缩阈值(PWET)的变化；于第14d取大鼠L4-5右侧脊髓采用RT-PCR和蛋白免疫印迹检测Cx43蛋白和mRNA表达，比较组间差异。
结果:三组大鼠基础痛阈无显著差异。组Ⅰ大鼠各观测时点PWTL、PWET无显著差异(P＞0.05)。组Ⅲ大鼠接受CCI术后第7d、14d都表现有右后肢PWTL、PWET明显降低(P＜0.01)，左后肢无明显变化。组Ⅱ大鼠CCI术后7d、14d左后肢PWTL、PWET有轻度升高；右后肢PWTL、PWET有显著降低，但明显高于组Ⅲ同时点痛阈(P＜0.01)。RT-PCR显示组ⅢCx43基因表达量分别为组Ⅱ的1.9倍，组Ⅰ的3.8倍。免疫印迹显示组Ⅰ、组Ⅱ和组ⅢL4/5右侧脊髓Cx43蛋白表达量分别为(8.4±2.5)、(17.1±4.0)和(3.9±5.2)。
结论:MK-801在有效防治CCI模型大鼠痛觉过敏现象的同时，大鼠脊髓星形胶质细胞Cx43表达量也显著下降。
第三部分缝隙连接阻断剂对大鼠慢性神经痛治疗作用的研究
目的:观察鞘内注射缝隙连接阻断剂甘珀酸(CBX)对大鼠坐骨神经结扎损伤(CCI)慢性神经痛的治疗作用及对脊髓原癌基因c-fos表达的影响。
方法:60只3周龄SD大鼠参照文献方法行32G聚氨酯鞘内导管并创建CCI慢性神经痛模型。右坐骨神经结扎前和结扎后第7d测定后肢热刺激回缩潜伏期(PWTL)、电刺激回缩阈值(pWET)的变化。CCI术后第8d，所有大鼠随机分为C0、C1、C5、C25、C100等5组(n=12)，分别鞘注CBX0μg，1μg，5μg，25μg，100μg。鞘内注射CBX0.5h、1h、2h、3h、4h、24h后测定大鼠后肢的PWTL和PWET。鞘内注射CBX1h后每组大鼠各取6例，采用RT-PCR和蛋白免疫印迹检测L4-5右侧脊髓c-fos表达。LSD法比较组间c-fos表达差异。
结果:各组大鼠CCI术后第7d右后肢PWTL、PWET均比术前显著降低(P＜0.01)。鞘注CBX后，C0、C1、C5、C25组左后肢PWTL、PWET无明显改变，C100组左后肢PWTL、PWET有所升高(p＜0.05)。鞘注CBX后，C1、C5、C25、C100组右后肢均表现有痛阈升高，PWTL、PWET呈剂量依赖性延长。此痛阈升高效应在鞘注CBX后0.5h作用最明显，3h后作用基本消失。RT-PCR显示鞘注不同剂量CBX后，各组大鼠右侧L4-5脊髓c-fosmRNA表达量以β-actin为参照分别为1.08，0.61，0.42，0.27，0.31(C0＞C1＞C5＞C25≈C100)。免疫印迹显示c-fos蛋白表达量C0组最高，C1、C5、C25、C100组比C0组分别下降22.4％、33.6％、38.6％、36.8％。
结论:鞘内注射CBX可短时间内降低CCI模型大鼠痛觉过敏现象，同时大鼠脊髓c-fos表达量也显著下降；鞘内注射缝隙连接可能是治疗慢性神经痛的有效辅助手段。