几丁质(chitin)是真菌细胞壁的重要结构成分,它与葡聚糖一起构成细胞壁坚固的骨架,对于维持细胞形态,防止外源物的入侵等起着重要的保护作用。同时,几丁质也是一种病原菌相关模式分子(Pathogen-Associated Molecular Pattern, PAMP),能诱导宿主的免疫应答；在一些致病真菌中(如植物病原真菌—稻瘟病菌等),几丁质合成酶已经被发现与致病性相关。罗伯茨绿僵菌(M.robertsii),是重要昆虫病原真菌,正在被开发为真菌杀虫剂,用于防治农业害虫,卫生害虫和它们所传播的疾病,但其存在着杀虫速度慢和防效不稳定的缺点,研究罗伯茨绿僵菌的致病机理可为创建高效安全的真菌杀虫剂提供理论依据。目前,几丁质合成酶与罗伯茨绿僵菌致病性相关的研究尚未被报导。为此,本文从罗伯茨绿僵菌(M. robertsii)中鉴定了所有几丁质合成酶,并阐明了它们在发育、致病和抗非生物逆境中的功能,主要结果分述如下：利用酿酒酵母(S. cerevisiae)和稻瘟病菌(M. oryzae)等的几丁质合成酶作为queries,我们从罗伯茨绿僵菌中鉴定到7个可能的几丁质合成酶,经结构域分析(PFAM database)发现,这7个蛋白均含有典型的几丁质合成酶结构域(domain structure);并且都有保守的CON1结构域(QxxEY, EDRxL, QxRRW).利用来自多个真菌几丁质合成酶的CON1序列进行系统发育分析发现,罗伯茨绿僵菌几丁质合成酶分别位于7个clades。根据结构域分析和系统发育研究的结果,我们把它们分别命名为ChsⅠ (Maa-02999)、ChsⅡ (Maa-02740)、ChsⅢ (Maa-03168)、ChsⅣ (Maa-00137)、Chs Ⅴ (Maa-01111)、ChsⅥ (Maa-01099) 和 ChsⅦ (Maa-01112)。通过表达分析我们发现,除了Chs Ⅵ,其他几丁质合成酶在生长发育和致病的各个阶段都表达；ChsⅤ和ChsⅦ有着类似的表达规律,在侵染阶段(附着胞阶段)和生长发育阶段(产孢结构、芽生孢子和萌发)都有比较强的表达,但附着胞阶段表达量最高。为了研究几丁质合成酶家族的生物学功能,我们构建以上7类几丁质合成酶的敲除株和回补株。在腐生阶段,ΔChsⅠ、ΔChsⅡ、ΔChsⅤ和ΔChsⅦ在PDA培养基上生长明显受到抑制。ΔChsⅤ和ΔChsⅦ的产孢量显著比野生型菌株降低,与此相对应,这两个突变体的产孢结构异常；与野生型菌株相比,突变体的分子孢子梗的数目明显减少。扫描电镜观察发现,ΔChsⅤ和ΔChsⅦ的细胞表面疏水结构(Rodlet structure)明显受损。与野生型菌株相比,ΔChsⅤ和ΔChsⅦ的侵染毒力明显降低。进一步发现,ΔChsⅤ和ΔChsⅦ的附着胞异常,附着胞内部有膨大的类似液泡的结构填充,ΔChsⅤ和ΔChsⅦ的附着胞膨压与野生型菌株相比明显降低。对罗伯茨绿僵菌的7类几丁质合成酶敲除株在非生物逆境(高温、高渗、氧化环境和细胞壁破损处理)条件下生长速率测定发现：在高温条件下ΔChsⅡ和ΔChsⅤ是致死的,ΔChsⅠ和ΔChsⅦ明显受到抑制；此外对来自9个门的231个真菌的几丁质合成酶家族进行分析,发现来自盘菌亚门(Pezizomycotina)的95个物种含有ChsⅤ和ChsⅦ,进一步分析发现它们在基因组上是通过基因的串联复制(Tandem duplication)产生的。在这95个物种中,78个是致病真菌,其中28个可以感染哺乳动物(耐高温),剩余17个腐生真菌中,10个具有耐高温特性,而其余7个真菌与哺乳动物病原真菌和耐高温性真菌的亲缘关系接近。因此,我们推测ChsⅤ和ChsⅦ的串联复制与真菌的耐高温性状相关。为此,我们分析了盘菌亚门另外两个真菌(稻瘟病和粗糙脉孢霉)的ChsⅤ和ChsⅦ与耐高温的关系,发现ChsⅤ和ChsⅦ均与这两个菌的耐高温相关。