白头翁皂苷糖苷酶的催化水解作用

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本论文以研究单底物白头翁皂苷酶转化为目标,筛选产酶菌种并优化培养条件,分离纯化了白头翁皂苷底物和酶解产物,并对白头翁皂苷糖苷酶的分子量,批量反应条件及酶性质进行了初步的研究。先行提取白头翁总皂苷的,采用白头翁植物根茎经醇提,AB-8、D-296大孔吸附树脂精制后,得到白头翁总皂苷;使用硅胶柱层析在氯仿、甲醇体积比8.5:1.5、8.3:1.7时洗脱出4种组分,得率为10.6%、13.8%、8.20%、15.3%,经HPLC检验其纯度为83.94%、81.99%、70.94%、83.40%。选择Absidia sp.P00r作为白头翁皂苷糖苷酶的生产用菌,转化总苷底物生成了27.9g产物,得率为69.75%;在氯仿、甲醇体积比8.5:1.5时洗脱出产物3种组分,得率为15.0%、7.10%、10.3%;经HPLC检验其纯度分别为90.99%、81.40%、99.90%。依次使用Sephadec G-100葡聚糖凝胶、DEAE-Cellulose52离子交换柱可分离纯化出两种白头翁皂苷糖苷酶,分子量分别为73.1kDa、58.8kDa。酶I最适pH为5.0,在pH4.0-7.0稳定;最适反应温度为40.C,在50.C以下稳定;K+、Na+、Mg2+、Ca2+对酶I的反应影响不大,其K+、Na+在低浓度的时候会有激活作用;Zn2+高浓度的时候抑制酶反应;Cu2+、Fe3+对酶反应抑制作用最强。酶反应动力学研究,酶Ⅰ的Km=17.44mmol/L,Vmax=0.386mmol/(L·min)。酶Ⅱ最适pH为5.0,在pH4.0-7.0稳定;最适反应温度为40℃,在50℃以下稳定;Na+、K+、Mg2+对酶Ⅱ反应影响不大,其中Mg2+、Na+在低浓度时候会有激活作用,高浓度Ca2+会抑制酶反应;Zn2+、Cu2+、Fe3+对酶反应抑制作用最强。酶反应动力学研究,酶Ⅱ的Km=15.58mmol/L,Vmax=0.319mmol/(L·min)。
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