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蛋氨酸又称甲硫氨酸,是家禽的第一限制性氨基酸。甜菜碱又名三甲基甘氨酸,可作为甲基供体促进机体物质代谢,在蛋氨酸循环中有重要作用。本试验采用组学技术研究仔鹅饲粮中添加甜菜碱替代蛋氨酸和缓解其中毒的影响机制。1.甜菜碱替代蛋氨酸对仔鹅生长和蛋白质代谢的影响本试验在蛋氨酸相对缺乏的扬州鹅饲粮(21-70 d基础饲粮蛋氨酸:0.28%)中添加3个水平蛋氨酸和2个水平甜菜碱,旨在研究甜菜碱替代蛋氨酸对仔鹅生长和蛋白质代谢的影响。采用2×3(甜菜碱×蛋氨酸)二因子多水平有重复交叉试验设计,试验选取300只21日龄健康、体重相近的扬州鹅公鹅,随机分成6组,每组5个重复,每个重复10只。甜菜碱添加水平为0和0.06%,DL-蛋氨酸添加水平为0、0.06%和0.12%。试验期49 d。全程网上平养,自由采食和饮水。测定生长性能、屠宰性能、血清生化指标和氨基酸利用率。结果显示:(1)0.12%蛋氨酸添加组仔鹅70d体重显著高于不添加蛋氨酸组(P<0.05)。添加甜菜碱对仔鹅生长性能指标无显著影响(P>0.05)。添加蛋氨酸对仔鹅屠宰性能指标无显著影响(P>0.05),添加甜菜碱显著提高70d仔鹅全净膛率和半净膛率(P<0.05),蛋氨酸与甜菜碱添加水平对屠宰率、半净膛率和全净膛率均有显著的交互作用(P<0.05)。添加甜菜碱显著提高70d仔鹅龙骨长、胫围和胸深(P<0.05)。(2)添加蛋氨酸显著提高70 d仔鹅血清总蛋白、白蛋白和球蛋白水平(P<0.05),添加甜菜碱显著降低血清甘油三脂(TG)水平(P<0.05)。(3)添加蛋氨酸显著提高67-70 d仔鹅对饲粮粗脂肪、蛋氨酸和半胱氨酸利用率(P<0.05),添加甜菜碱显著提高67-70 d仔鹅对饲粮谷氨酸和半胱氨酸利用率(P<0.05)。(4)添加蛋氨酸显著提高肝脏粗蛋白水平(P<0.05),添加甜菜碱显著降低肝脏粗脂肪水平(P<0.05)。添加蛋氨酸显著提高腿肌半胱氨酸和苯丙氨酸水平(P<0.05),添加甜菜碱显著提高胸肌天冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量(P<0.05)。添加蛋氨酸与甜菜碱对腿肌总氨基酸含量有显著的交互作用(P<0.05)。由此可见,饲粮中添加适宜水平的蛋氨酸(0.34%-0.40%)有利于提高仔鹅生长性能,促进蛋白质合成。甜菜碱对生长性能所起作用不及蛋氨酸,但可促进仔鹅的骨骼发育,改善屠宰性能。2.转录组学研究甜菜碱替代蛋氨酸对仔鹅肝脏基因组表达的影响本试验采用转录组学技术研究甜菜碱替代蛋氨酸对鹅肝脏基因表达和关键基因启动子区域DNA甲基化水平的影响。当试验一仔鹅70 d时,分别从对照组(Met:0.28%),蛋氨酸组(0.12%LDL-蛋氨酸)和甜菜碱组(0.06%的盐酸甜菜碱),随机选取3只鹅,无菌采集肝脏组织样,液氮速冻,分别提取RNA和DNA用于RNA-Seq和DNA甲基化水平检测。结果显示:(1)转录组测序9个肝脏样品,共获得114 460个Transcript和86 683个Unigene,Q30碱基百分比大于95.34%。蛋氨酸组蛋氨酸循环通路基因(TDH和IL4I1)表达水平显著上调,甜菜碱组能量代谢和转移通路基因(LOC106049515)表达水平显著上调。(2)利用DNA亚硫酸氢钠修饰方法检测IL4I1和LOC106032502基因启动子区域DNA甲基化水平,甜菜碱组、蛋氨酸组与对照组IL4I1基因启动子区域甲基化水平无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,蛋氨酸组和甜菜碱组LOC106032502基因启动子区域甲基化水平显著降低,但其基因表达水平显著提高(P<0.05)。由此可见,在蛋氨酸相对缺乏的仔鹅饲粮中添加蛋氨酸和甜菜碱均改变了肝脏基因组转录调控网络和LOC106032502基因启动子区域甲基化水平,且通过调控不同代谢途径的基因影响鹅肝脏基因组表达。3.蛋氨酸诱导的高同型半胱氨酸血症仔鹅模型的构建本试验在仔鹅饲粮中添加过量蛋氨酸构建高同型半胱氨酸血症仔鹅模型,选取100只14日龄健康、体重相近的扬州鹅公鹅,随机分成2组(对照组和中毒组),每组5个重复,每个重复10只。对照组饲喂基础饲粮,中毒组在基础饲粮的基础上添加1%蛋氨酸。检测仔鹅临床症状和剖检后的心脏的病理变化和血清同型半胱氨酸水平。结果显示:血清同型半胱氨酸(Hcy)水平是判断高同型半胱氨酸血症的敏感指标,可作为判定标准。血清Hcy水平大于30 μmol/L定义为高同型半胱氨酸血症仔鹅(正常水平16-21 μmol/L)。饲粮中蛋氨酸含量为1.35%会引起蛋氨酸中毒,导致仔鹅高同型半胱氨酸血症。4.全基因组甲基化与LncRNA转录组测序分析高同型半胱氨酸血症对仔鹅心脏组织的影响采用全基因组甲基化(WGBS)和LncRNA转录组测序分析高同型半胱氨酸血症仔鹅心脏组织基因甲基化和表达谱的变化,揭示高同型半胱氨酸血症的表观遗传致病机理。当试验三仔鹅70 d时,分别从对照组和中毒组随机取3只鹅,屠宰后立即无菌采集心脏组织样品,提取组织DNA和RNA用于全基因组甲基化(WGBS)和LncRNA转录组测序。结果显示:(1)同型半胱氨酸血症组仔鹅和对照组心脏全基因组甲基化水平存在显著差异,共筛选出6 592个差异甲基化基因,18 023个差异区域。基因组甲基化主要发生在CG位点上,且这些差异基因主要分布在位于内含子(Intron)中,占基因体结构的DMR总数的56.44%。(2)差异甲基化水平基因富集在126个KEGG的通路中,其中差异基因主要集中在氨基酸代谢、心肌代谢和细胞调亡等相关通路。这些通路均与氨基酸代谢、肌肉生长发育及心肌组织生长密切相关,其中参与细胞凋亡的有p53信号调节通路(p53 signaling pathway)和凋亡通路(apoptosis)等。(3)LncRNA转录组测序结果显示:同型半胱氨酸血症组仔鹅比对照组共筛选到352个差异表达的mRNA,192个上调基因和160个下调基因。筛选到3 427个差异表达的LncRNA,其中有1873个上调基因和1 554个下调基因。(4)对每组差异基因进行KEGG pathway富集分析发现,总共有232个mRNA富集在88个通路上,其中显著富集的前20个通路中,同型半胱氨酸血症组仔鹅比对照组显著上调的有:凋亡(Apoptosis)、血管平滑肌收缩(Vascular smooth muscle contraction)、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)等,下调的有:苯丙氨酸代谢(Phenylalanine metabolism)和酮体的合成与降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)等。(5)基因组DNA甲基化与LncRNA转录组测序联合分析发现,甲基化水平与基因表达水平呈负相关的基因共富集到51个GO term中,其中富集在分子功能的GO term有5个。基因主体(Genebody)区域甲基化水平与基因表达水平呈负反馈调节的有26个,正反馈调节的有25个。差异基因启动子(Gene promoter)区域甲基化水平与基因表达水平呈负反馈调节的有26个,正反馈调节的有3个。由此可见,蛋氨酸中毒可改变细胞凋亡、心肌代谢和氨基酸代谢通路基因甲基化水平,改变凋亡和血管平滑肌收缩通路基因表达水平。启动子区域基因甲基化与表达水平主要是呈负反馈调节,而Genebody区域正反馈与负反馈调节两者都有。5.甜菜碱对高同型半胱氨酸血症仔鹅的缓解作用本试验采用试验三构建高同型半胱氨酸血症模型,解毒组给予甜菜碱干预,研究甜菜碱对蛋氨酸诱导的高同型半胱氨酸血症仔鹅的缓解作用。选取150只14日龄健康、体重相近的扬州鹅公鹅,随机分成3组(对照组、中毒组和解毒组),每组5个重复,每个重复10只。对照组饲喂基础饲粮,中毒组在基础饲粮上添加1%蛋氨酸,解毒组在中毒组饲粮上添加0.2%甜菜碱。试验期为56 d。测定生长性能、屠宰性能、血清生化指标和氨基酸利用率。结果显示:(1)中毒组28 d、49 d和70 d仔鹅血清同型半胱氨酸水平显著高于对照组(P<0.05),解毒组70d仔鹅血清同型半胱氨酸水平显著低于中毒组(P<0.05),与对照组无显著差异(P>0.05)。(2)中毒组28 d、49 d和70 d体重显著低于对照组(P<0.05),解毒组70 d体重与中毒组无显著差异(P>0.05),中毒组和解毒组14-28 d仔鹅平均日采食量和平均日增重显著低于对照组(P<0.05)。(3)添加过量蛋氨酸阻碍鹅羽毛生长,降低羽绒质量,添加甜菜碱可降低羽毛耗氧指数,提高羽绒质量。(4)蛋氨酸中毒饲粮中添加甜菜碱可显著提高BHMT和MS基因表达水平促进Hcy合成蛋氨酸,降低血清Hcy水平,缓解鹅高同型半胱氨酸血症。由此可见,基础饲粮(14-28 d Met:0.35%;28-70 d Met:0.36%)上添加1%DL-蛋氨酸会引起蛋氨酸中毒,降低仔鹅生长性能、屠宰性能和养分利用率,导致仔鹅高同型半胱氨酸血症。而添加0.2%甜菜碱可显著降低血清Hcy水平,降低腹脂率和全净膛率,提高仔鹅对饲粮粗脂肪、粗灰分和氨基酸利用率,缓解仔鹅高同型半胱氨酸血症。6.高同型半胱氨酸血症候选基因功能的初步验证本试验采用TUNEL化学染色检测心肌细胞凋亡率,旨在验证高同型半胱氨酸血症通过p53依赖的凋亡途径诱导心肌损伤。当试验五仔鹅70日龄时,分别从对照组,中毒组和解毒组中采集5只鹅的心肌组织,制备心肌组织载玻片用于TUNEL和免疫组化。结果表明:蛋氨酸过量导致的高同型半胱氨酸血症仔鹅显著提高心肌细胞凋亡率,其机理是通过降低心肌B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表达促使细胞发生凋亡,甜菜碱可明显缓解心肌细胞凋亡率,但对p53凋亡途径无显著影响。高同型半胱氨酸血症组仔鹅心脏组织Bcl-2甲基化水平提高,负反馈抑制Bcl-2基因表达,导致心肌细胞凋亡,引起高同型半胱氨酸血症。