研究目的: 1.观察温度、葡萄糖浓度、一氧化氮对马尔尼菲青霉的生长及其乙醛酸循环、糖异生、糖酵解代谢过程的影响。 2.观察巨噬细胞内微环境变化对马尔尼菲青霉的生长及其乙醛酸循环、糖异生、糖酵解代谢过程的影响。 3.探讨乙醛酸循环在马尔尼菲青霉致病中的作用。 实验对象和方法: 1.马尔尼菲青霉菌丝相、酵母相及分生孢子的获取：马尔尼菲青霉SUMS0152株，接种于装有20ml沙堡弱葡萄糖液体培养基的摇瓶中，25℃150 r/min振荡孵育72h，离心收集菌丝体；接种于脑心浸汁(BHI)固体培养基上，每3天传代1次，数次传代后，至镜下观察基本为酵母相细胞时，再接种于装有20ml BHI液体培养基的摇瓶中，37℃150 r/min振荡孵育72h，离心收集酵母相细胞；将马尔尼菲青霉接种于PDA培养基，25℃孵育14d，用无菌生理盐水冲洗培养基表面，过滤去除菌丝，离心收取分生孢子。 2.实验分组： 第一类分组：分为4组，每组4个样本。菌丝相含糖培养组(MG)将菌丝悬于20m10.17﹪YNB+2﹪葡萄糖的培养基中；菌丝相无糖培养组(MN)将菌丝悬于20ml 0.17﹪YNB+2﹪乙酸盐的培养基中，两组均25℃150 r/min振荡孵育12h。酵母相含糖培养组(YG)将酵母细胞悬于20m10.17﹪YNB+2﹪葡萄糖的培养基中；酵母相无糖培养组(YN)将酵母细胞悬于20ml 0.17﹪’YNB+2﹪乙酸盐的培养基中，两组均37℃ 150 r/min振荡孵育12h。以上述各组培养基加入1.5﹪琼脂制成相应的固体培养基，接种P.m分生孢子，观察菌落生长情况；以改良SDA、BHI接种P.m分生孢子，25℃、37℃观察菌落生长情况。 第二类分组：马尔尼菲青霉酵母细胞按接种的培养基(pH5)分组，高糖(1﹪葡萄糖)培养基中按加入0mM、1mM、2mM、3mM的NaNO<,2>分为H0、H1、H2、H3共4组；低糖(0.1﹪葡萄糖)培养基中按加入0mM、1mM、2mM、3mM的NaNO<,2>分为L0、L1、L2、L3共4组，每组各4个样本。 第三类分组：分为4组，每组4个样本。0组将马尔尼菲青霉接种于DMEM(0.45﹪葡萄糖)细胞培养基中，37℃ 150rpm孵育48h；1组将马尔尼菲青霉分生孢子与RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞系)共培养于DMEM细胞培养基中，37℃5﹪CO<,2>的温箱中孵育6h，弃去细胞外马尔尼菲青霉继续孵育48h；2组在1组的基础上，于培养体系中加入rMulFN-γ和LPS以刺激RAW264.7细胞;3组在2组的基础上，于培养体系中加入一氧化氮合酶抑制剂LNMMA。1、2、3组弃去细胞外马尔尼菲青霉，获取细胞内马尔尼菲青霉作为样本。 3.荧光定量RT-PCR检测： 提取各实验组马尔尼菲青霉样本的总RNA，反转录获得cDNA，采用各自的特异性引物进行real-time PCR，分析各组马尔尼菲青霉ICL1、PCKl、PFK2的基因相对转录水平。 4.ICL1酶活性检测： 采用玻璃珠破壁获取马尔尼菲青霉具有活性的总蛋白，加入异柠檬酸37℃孵育1h，加入6.4M盐酸胍终止反应后再加入2-硝基苯酸，室温反应10min，采用分光光度计检测最终产物硝基苯酸的A<,412>值，以校正的A<,412>值反映ICL1蛋白的量及活性。 5.NO含量检测： 按照NO检测试剂盒说明书操作，取细胞培养上清液、20 μ mol/L亚硝酸钠标准液、蒸馏水各1ml，加入反应试剂一0.8ml、试剂二0.4ml，混匀后，放置10min，4000rpm离心10min，取澄清上清液0.8ml，加入显色剂0.4ml，混匀，15min后在550nm检测吸光度OD值，根据公式计算NO含量。 6.马尔尼菲青霉生长情况的比较： 固体培养基上采用菌落直径进行比较。液体培养基中马尔尼菲青霉酵母细胞悬液经50W超声波处理3min后，采用DU70分光光度仪检测340nm吸光度，比较A<,340>值。巨噬细胞内马尔尼菲青霉采用菌落计数进行比较。 7.统计学处理： 正态分布计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；两因素单独效应、主效应及交互效应采用2×2析因分析；非正态分布计量资料组间比较采用秩和检验，两变量相关关系采用Spearman等级相关分析。采用SPSS11.5统计软件包处理实验数据，显著性水准α设为0.05。 结果: 1.温度、葡萄糖浓度对马尔尼菲青霉生长及乙醛酸循环的影响相同葡萄糖浓度下，菌丝相较酵母相生长更迅速(p<0.05)；随着葡萄糖浓度降低，菌丝相和酵母相生长速度均下降(p<0.05)，但酵母相生长速度下降幅度较小。 2.一氧化氮对马尔尼菲青霉生长及乙醛酸循环的影响一氧化氮对马尔尼菲青霉酵母相ICL1、PCK1、PFK2的转录及ICL1的蛋白表达和活性具有明显抑制作用，随着一氧化氮浓度上升，抑制作用增强(p<0.01)。低糖相对于高糖对ICL1转录及其蛋白表达和活性具有诱导效应，随着一氧化氮浓度上升，该诱导效应明显减弱(p<0.01)。 一氧化氮对低糖和高糖培养基中的马尔尼菲青霉的生长均有抑制作用，并且随一氧化氮浓度上升抑制作用增强(P<0.01)。随着一氧化氮浓度上升，低糖组相对于高糖组的存活率也明显下降(P<0.01)。低糖对ICL1转录水平的诱导效应，与马尔尼菲青霉的低糖存活率呈正相关(r<,s>=0.99，P<0.01)。 3.巨噬细胞内微环境对马尔尼菲青霉生长及乙醛酸循环的影响ICL1、PCK1转录水平及ICL1的蛋白表达和活性，均显示为3组>2组>1组>0组(0组为细胞外，1组为细胞内，2组为活化的细胞内，3组为活化但不能产生NO的细胞内)，各组间差异有统计学意义。PFK2转录水平显示0组>1组>3组>2组，仅2组与其他组差异有统计学意义。 经IFN-γ、LPS刺激的RAW264.7细胞产生的活性氮成分明显增加(P<0.01)，对细胞内马尔尼菲青霉生长有明显抑制作用(P<0.01)。抑制活性氮成分的产生，可恢复马尔尼菲青霉的生长。 结论: 1.首次设计相关引物，采用荧光定量RT-PCR检测了马尔尼菲青霉ICL1、PCK1、PFK2的转录水平，各产物均为单一片段，符合检测标准。 2.建立了小鼠巨噬细胞系吞噬马尔尼菲青霉的共培养体系，发现未经IFN γ等刺激的巨噬细胞产生微量的NO，不能有效地杀灭P.m；经IFN γ等刺激的巨噬细胞产生较大量的NO，可明显杀灭P.m；刺激后加入NOS抑制剂的巨噬细胞产生NO明显减少，对P.m杀灭作用减弱；共培养体系可很好地模拟正常宿主或免疫缺陷宿主巨噬细胞与P.m的相互作用。 3.37℃生长和葡萄糖缺乏的环境均可诱导乙醛酸循环、糖异生代谢加强，使碳源向葡萄糖方向流动，两因素的诱导作用具有协同效应。在葡萄糖缺乏的环境中，马尔尼菲青霉酵母相的乙醛酸循环、糖异生较菌丝相更为活跃，使其酵母相细胞更能耐受低糖的微环境。 4.NO抑制乙醛酸循环、糖异生、糖酵解，抑制P.m酵母相细胞生长，抑制作用随NO浓度上升而增强。NO对低糖环境下P.m酵母相细胞生长的抑制作用更明显，说明NO可在一定程度上通过抑制乙醛酸循环来杀灭马尔尼菲青霉酵母相细胞。 5.在未经IFN γ刺激的巨噬细胞内，马尔尼菲青霉乙醛酸循环、糖异生代谢加强，P.m能继续生存；在经：IFN γ刺激但不能产生足够NO的巨噬细胞内，P.m乙醛酸循环、糖异生代谢进一步加强，P.m仍能生存：在经IFN γ刺激产生足够NO的巨噬细胞内，P.m乙醛酸循环、糖异生代谢被抑制，P.m被大量杀灭。P.m在巨噬细胞内的生存既与其乙醛酸循环的活性明显相关，也取决于巨噬细胞的功能状态。乙醛酸循环在P.m致病过程中起着重要作用，同时宿主的免疫功能也是发病与否的关键因素。 6.马尔尼菲青霉ICL1的表达可能存在多途径、多层次的调控；ICL1与其它可能的致病因子之间是否存在相互调节的网络，目前也不甚清楚。所以下一步研究计划包括：1)对马尔尼菲青霉ICL1蛋白表达的具体调节过程和机制进行深入研究；2)筛选马尔尼菲青霉ICL1基因及其它基因缺陷株，进一步寻找马尔尼菲青霉的致病因子，并探讨这些致病因子间的相互关系。基于以上研究，为可能将ICL1作为靶点治疗马尔尼菲青霉病打下基础。