菊花脂肪酸脱饱和酶基因CmFAD7的克隆与表达分析

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ω-3脂肪酸去饱和酶是不饱和脂肪酸合成途径中催化二烯脂肪酸(Dienoic Fatty Acids,简称:DAs)转化为三烯脂肪酸(Trienoic Fatty Acids,简称:TAs)的关键酶。其含量的变化能改变脂肪酸的组成,影响相变温度,改变植株对低温胁迫的抗性。本试验以秋菊抗寒品种‘星光灿烂’为材料,从菊花叶片中分离出叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶(CmFAD7)基因,对其序列进行分析,并结合不同温度下叶片和根系中CmFAD7基因的表达情况和脂肪酸含量分析,阐述其低温胁迫下表达模式。本研究获得的主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR方法从菊花叶片中克隆叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶(CmFAD7)基因的中间片段,采用RACE的方法分别克隆5’和3’端序列,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。ω-3脂肪酸去饱和酶基因编码区共有1284bp,推测其编码428个氨基酸,相对分子量为48.98KD,基因注册号为KC567246。2.CmFAD7基因同源序列比较发现,该基因片段编码的氨基酸与同科的高山还阳参(CaFAD7)和红花(CtFAD7/8)脂肪酸去饱和酶基因的同源性最高,分别为84%、83%。与其它物种的ω-3脂肪酸去饱和酶家族的氨基酸序列具有较高的相似性(图15),如PfFAD7(78%)、EgFAD7(77%)、AtFAD8(71%)、ZmFAD8(67%)、PoFAD8(54%)、AtFAD3(58%)、BnFAD3(58%),此基因含有△12-FADs保守结构域和3个跨膜螺旋,N-端含有一段叶绿体转运肽,属于膜脂肪酸去饱和酶超级家族。并且有四个的保守结构域,其中后三个保守区富含组氨酸,是维持其膜结合类酶特性所必需的。进化树分析表明,该基因与质体型FAD7中高山还阳参(CaFAD7)、红花(CtFAD7/8)的亲缘关系最近,与质体型FAD8的亲缘关系次之,与内质网型FAD3亲缘关系较远,因此命名为CmFAD7。3.叶片和根系中CmFAD7基因的表达分析表明,不同处理温度下,CmFAD7基因叶片中的表达量高于根系。随着温度的降低,叶片中CmFAD7表达量先升后降,-4℃时最高,分别是16、5、-8℃条件下的13.5、2.6、7.6倍;根系中的表达趋势与叶片相似,5℃时达最高值,随后逐渐下降。脂肪酸含量变化表现为,叶片中不饱和脂肪酸以C18:3含量最高,从16℃降低至-8℃时,C18:2含量轻微下降,C18:3含量则表现出逐渐上升趋势,-8℃时含量最高(66.09%),上升幅度为32.68%。根系中不饱和脂肪酸以C18:2含量最高,在总脂肪酸中的含量为35.49%~46.97%;随温度降低,C18:2含量有上升趋势,C18:3含量表现出先升后降的趋势,但差异不明显;5℃时,C18:3含量最高(18.26%),这与5℃时菊花根系中CmFAD7基因的表达情况相一致。
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