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苦荞麦(Fagopyrum tataricum 是一种药食同源的作物,富含以芦丁为主的黄酮醇类化合物。黄酮醇合酶(Flavonol Synthase,FLS)是黄酮醇生物合成的关键酶,其酶催产物为槲皮素、山奈酚和杨梅素,其中槲皮素和山奈酚可转化为芦丁。本研究以苦荞花期植株为研究材料,利用RT-PCR分子生物学技术,成功获得苦荞FtFLS同源基因,应用生物信息技术对其功能进行了预测;利用原核表达技术实现了苦荞黄酮醇合酶在大肠杆菌中有活性的表达;利用荧光定量PCR技术,分析了苦荞花期茎、叶、花各组织中黄酮醇合酶基因转录水平上的表达量;利用高效液相色谱法(HPLC),测定了苦荞花期各组织中黄酮醇化合物的含量;利用紫外分光光度法等技术比较了黄酮醇合酶对三种底物的酶催活性,分析了其在苦荞的芦丁合成中的最适底物。本研究主要取得了以下研究结果:1、采用RT-PCR技术,成功获得2条苦荞黄酮醇合酶同源基因的ORF序列,命名为FtFLS4和FtFLS5。苦荞FtFLS4基因ORF为1026 bp,可编码341个氨基酸,理论分子量39.2kDa,预测pI5.79,分子式C1777H2739N4630515S11;FtFLS5基因ORF为1068 bp,可编码355个氨基酸,理论分子量40.1 kDa,预测pI为7.18,分子式为C1816H2821N4870514S12。分子鉴定结果表明,所得序列属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族成员,为苦荞黄酮醇合酶同源基因。2、将FtFLS4和FtFLS5重组到表达载体pET-30(b)中进行原核表达,电泳分别检测到两条约为45kDa的融合蛋白,与预测的分子量相符;将利用亲和层析技术获得纯化后的酶蛋白液,使用薄层层析和紫外分光光度法测定酶活力,结果表明,FtFLS4和FtFLS5重组蛋白均具有将二氢黄酮醇(二氢槲皮素,二氢山奈酚和二氢杨梅素)转化为黄酮醇的活力;FtFLS4的总酶活分别为0.630×10-3IU、1.2×10-3IU和 0.476×10-3IU;FtFLS5 的总酶活分别为 0.602×10-3IU、0.981×10-3IU 和 0.303×10-3 IU。3、采用AlC13法和HPLC方法测定苦荞花期茎叶花中黄酮含量,结果表明,苦荞花芽中总黄酮含量最高为5.47%(DW),叶中含量为2.67%(DW),茎中含量为0.17%(DW);杨梅素仅存在于叶(0.32mg/g)和花(0.23mg/g);槲皮素仅存在于叶(0.08mg/g)和花(5.85mg/g)中;山奈酚在叶中含量较高(0.40mg/g),花(0.07mg/g)和茎(0.05mg/g)中含量较低。采用荧光定量PCR检测5个FtFLS同源基因在相应组织中的表达量,结果表明,FtFLS同源基因在苦荞的茎、叶和花中均有表达且存在组织特异性。茎中,FFLS1和FtFLS3表达量最高,FtFLS2和FtFLS4表达量次之,FtFLS5几乎不表达;叶中,表达量为FtFLS3>FtFLS1>FtFLS2>FtFLS4>FtFLS5;花中,表达量为 FtFLS3>FtFLS1>FtFLS2>FtFLS4>FtFLS5。利用SPSS Statistics对黄酮醇含量和FtFLS的相对表达量进行相关性分析,结果表明,芦丁含量与FtLS1和FtFLS5相关性较高,成正相关,与FtFLS2、FtFLS3和FtFLS4相关性较低;杨梅素含量与FtFLS2和FtFLS4相关性较高,成正相关,与FtFLS1、FtFLS3和FtFLS5相关性较低;槲皮素含量与FtFLS1和FtFLS5相关性较高,成正相关,其他均为负相关;山奈酚含量与FtFLS2、FtFLS3和FtFLS4相关性较高,成正相关,其他均为负相关。