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油菜是重要的油料作物,收获前和收获时的裂果现象给生产造成严重损失。本论文首先通过生物信息学蛋白序列比对方法,寻找甘蓝型油菜与开裂相关的基因,进一步克隆了2个基因组基因以及1个基因的片段,并进行了时空表达分析。在此基础上构建载体,建立和优化油菜遗传体系进行转基因工作,并对获得的拟转化植株进行了初步的分子鉴定。获得以下主要结果:
1.通过与十字花科拟南芥果实开裂基因的核苷酸序列及其氨基酸序相比较,发现油菜BnFUL、BnSHP1、BnSHP2与拟南芥AtFUL、AtSHP1、AtSHP2的相似度分别高达93%、92%、92%;PFAM软件分析表明,可能与油菜果实开裂相关基因都有一个约50个AA的MADS-box保守结构域,这与拟南芥是相同的。因此我们预测BnFUL、BnSHP1、BnSHP2可能调控油菜果实开裂的过程。
2.以油菜基因组DNA为模板,克隆并测定了BnSHP1、BnSHP2的编码区序列。结果表明:BnSHP1基因编码区长达2756 bp,有7个外显子和6个内含子;BnSHP2基因编码区长达3238bp,有6个外显子和5个内含子。
3.通过RT-PCR对BnFUL、BnSHP1、BnSHP2时空表达进行了分析,结果表明,BnFUL在植物各个器官中广泛表达,BnSHP1、BnSHP2有相似的表达模式,主要在花和果实中表达;BnSHP2在茎、叶、花序轴均没有表达,而BnSHP1在茎中有微量得表达,叶和花序轴中没有表达。
为了确认油菜开裂基因的功能,我们利用中间表达载体pSK和植物双元表达载体pCanG,构建了BnFUL超表达、BnSHP2 RNA干涉植物表达载体,并将它们成功转入根癌农杆菌LBA4404中。
通过对根癌农杆菌转化多种因素的比较和探索,优化了农杆菌介导的油菜遗传转化体系。采用甘蓝型油菜从子叶节处切开的带柄子叶为外植体,经农杆菌感染10~30 min,共培养48 h,在含卡那霉素(Kan)8~10 mg/L和氨苄青霉素(Amp)100 mg/L的培养基上筛选得到转化体。以BnFUL超表达、BnSHP2 RNA干涉植物表达载体转化甘蓝型油菜,结果表明:经过卡那霉素筛选,BnFUL和BnSHP2转化分别获得48和15株抗性再生植株,以新霉素磷酸转移酶基因NPT Ⅱ的引物对抗性植株基因组DNA进行了PCR检测,BnFUL和BnSHP2分别有3和2株PCR检测为阳性。BnFUL超表达载体转化,转化效率为0.18%;BnSHP2干涉载体转化,转化效率为0.12%。
本研究为通过分子育种手段为抗裂果新品种的培养奠定基础。