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在多元平行构建基因(DNA)的过程中,需要大量短的人工合成的寡核苷酸(oligos)作为材料。通过传统碱基按序合成的方法来合成各种预期的基因或者基因组序列序列既浪费时间又浪费资金,而且合成的目标序列出错率极高。然而,目前微芯片技术的应用为我们大规模平行合成寡核苷酸提供了一种相对简单便捷,同时又高效经济的方法。由此使得人工合成基因的过程可以简便的通过连接组装短的寡核苷酸来实现。而微流体芯片方法的建立和微流PicoArrav的开发打破了寡核苷酸合成的瓶颈,使得寡核苷酸的合成与纯化很容易在芯片上就可以进行。我们利用可程序控制的微流体PicoArray芯片平行合成多元riboswitch寡核苷酸,这些多元寡核苷酸经过人为设计和改良,用于体外组装多元riboswitch基因。这些寡核苷酸合成后经过回收和纯化,然后混合成为寡核苷酸混合物(OligoMix)。在OligoMix丰度扩增富积及随后的组装中,我们对PCR扩增条件以及组装条件分别进行了优化比较,获得了相对保真的组装材料和较为稳定的体外组装条件。由于这些组装的寡核苷酸序列来源于197条riboswitch序列(总长度合计约40kb),对合成序列鉴定发现,同时在一管溶液中组装多元riboswitch(simultaneousassemblingmultiplexriboswitches,SAMRs)表现出了更高的保真性,而且更加经济高效。我们以直接测序结果作为依据,将每条测序结果与输出序列模板进行比对,统计分析碱基出错率。碱基出错可能产生并积累于OligoMix芯片原位合成及后续的PCR过程中,合成结果综合出错率为2.78‰,比传统方法直接合成相应长度的序列出错率大为降低。五种类型合计197条riboswitch在已测序40个样品中出现了四种,其中类型比较低的riboswitch,如TPP-ribowitch(2%)和Glycine-riboswitch(1.5%)也出现在测序结果中,且某个riboswitch序列尚未重复出现,仅是占总类型比1%的FMN-riboswitch在目前测序结果中未出现,说明序列分布在该水平是较为均匀的。以SAMRs方法合成的riboswitchDNA序列作为模板进行体外转录,从而生产出毫克水平的riboswitchncRNAs,且通过小分子化合物结合验证和RT-PCR、克隆、测序等序列还原性验证,说明合成的riboswitch具有特异性结合相应配体并可发生构象重排的生物学活性,产物可以被用来进行随后的基因表达途径调控等基因操作和生物学应用。
从芯片产生的OligoMix到合成的完整的多元riboswitch,全部过程包括芯片输出设计寡核苷酸、丰度富积(CLROM-PCR)、杂合退火连接(HAL)、组装和组装后扩增(F-PCR)、克隆、测序验证以及体外转录等,全部过程可在一周内完成。这套合成条件经过优化,原来用于合成预期长度riboswitch的SAMRs策略,同样可以被类似地应用合成任意基因序列。