基于微流体芯片体外从头合成多元“核糖开关”研究

来源 :浙江理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huangfei1117
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
在多元平行构建基因(DNA)的过程中,需要大量短的人工合成的寡核苷酸(oligos)作为材料。通过传统碱基按序合成的方法来合成各种预期的基因或者基因组序列序列既浪费时间又浪费资金,而且合成的目标序列出错率极高。然而,目前微芯片技术的应用为我们大规模平行合成寡核苷酸提供了一种相对简单便捷,同时又高效经济的方法。由此使得人工合成基因的过程可以简便的通过连接组装短的寡核苷酸来实现。而微流体芯片方法的建立和微流PicoArrav的开发打破了寡核苷酸合成的瓶颈,使得寡核苷酸的合成与纯化很容易在芯片上就可以进行。我们利用可程序控制的微流体PicoArray芯片平行合成多元riboswitch寡核苷酸,这些多元寡核苷酸经过人为设计和改良,用于体外组装多元riboswitch基因。这些寡核苷酸合成后经过回收和纯化,然后混合成为寡核苷酸混合物(OligoMix)。在OligoMix丰度扩增富积及随后的组装中,我们对PCR扩增条件以及组装条件分别进行了优化比较,获得了相对保真的组装材料和较为稳定的体外组装条件。由于这些组装的寡核苷酸序列来源于197条riboswitch序列(总长度合计约40kb),对合成序列鉴定发现,同时在一管溶液中组装多元riboswitch(simultaneousassemblingmultiplexriboswitches,SAMRs)表现出了更高的保真性,而且更加经济高效。我们以直接测序结果作为依据,将每条测序结果与输出序列模板进行比对,统计分析碱基出错率。碱基出错可能产生并积累于OligoMix芯片原位合成及后续的PCR过程中,合成结果综合出错率为2.78‰,比传统方法直接合成相应长度的序列出错率大为降低。五种类型合计197条riboswitch在已测序40个样品中出现了四种,其中类型比较低的riboswitch,如TPP-ribowitch(2%)和Glycine-riboswitch(1.5%)也出现在测序结果中,且某个riboswitch序列尚未重复出现,仅是占总类型比1%的FMN-riboswitch在目前测序结果中未出现,说明序列分布在该水平是较为均匀的。以SAMRs方法合成的riboswitchDNA序列作为模板进行体外转录,从而生产出毫克水平的riboswitchncRNAs,且通过小分子化合物结合验证和RT-PCR、克隆、测序等序列还原性验证,说明合成的riboswitch具有特异性结合相应配体并可发生构象重排的生物学活性,产物可以被用来进行随后的基因表达途径调控等基因操作和生物学应用。 从芯片产生的OligoMix到合成的完整的多元riboswitch,全部过程包括芯片输出设计寡核苷酸、丰度富积(CLROM-PCR)、杂合退火连接(HAL)、组装和组装后扩增(F-PCR)、克隆、测序验证以及体外转录等,全部过程可在一周内完成。这套合成条件经过优化,原来用于合成预期长度riboswitch的SAMRs策略,同样可以被类似地应用合成任意基因序列。
其他文献
摘要:信息技术课是一门实践性很强的学科,在学习过程中,要求学生必须掌握一定的计算机操作技能和操作技巧。作为一名初中信息技术教师,如何让学生喜欢这门课,并且能在喜欢的情况下学好这门课呢?对于此,笔者在教学过程中进行了一些思考,现做一总结。  关键词:信息技术;反思;教师;学生  中图分类号:G632.0 文献标识码:A 文章编号:1992-7711(2017)08-0093  信息技术课是一門实践性
L-谷氨酰胺(L-Glutamine,简称Gln)是由L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化而来的一种条件必须氨基酸。它是一种极有发展前途的新药,在临床上主要用于治疗脑神经疾病及消化道溃疡。世界上
摘要:社区资源是语文教学中非常重要的校外课程资源。社区资源在文学类作品、语言文字应用、实用类文本和地方校本课程的资源开发和教学实施中都有广泛的应用,有助于提升语文教学的趣味。  关键词:社区资源;高中语文;教学品质  中图分类号:G633.3 文献标识码:A 文章编号:1992-7711(2017)08-0094  社区资源是语文教学中非常重要的校外课程资源。让学生走出封闭的课堂,走向广阔的社会,
1961年生。毕业于解放军艺术学院美术系油画专业,中央美术学院油画系第十二届助教研修班,中央美术学院油画系首届油画艺术硕士,中国美术家协会会员。现工作于中国军事博物馆美术创作室。  他以充满激情的笔触,饱和的色彩,尽情地表达一个男人的对绘画的热爱!  ——中国艺术研究院中国油画院院长、博士生导师 杨飞云  周武发的作品无疑追求着一种叙事的记录性,其实,任何高贵的艺术都离不开对于生命本真状态的呈现与
随着小麦基因组序列信息的增多,现在面临的主要问题是如何研究小麦基因的生物学功能。利用突变体来分析鉴定基因的功能最为直接有效。本研究利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯EMS、