论文部分内容阅读
目的:宫颈癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤。近年来,宫颈癌的发病人群逐年趋于年轻化,严重危害女性健康。随着肿瘤分子病理、基因检测等现代分子生物学领域研究成果,参与宫颈癌发生发展的各种基因或蛋白被陆续发现,但目前尚无用于宫颈癌治疗的靶向药物上市。而FLCN是一个与多种肿瘤发生、发展密切相关的基因,而目前其与宫颈癌之间的关系尚不明确。本研究旨在探索folliculin(FLCN)基因在宫颈鳞癌组织中的表达情况,探讨其对宫颈鳞癌SiHa细胞增殖和凋亡能力的影响,为进一步研究FLCN在宫颈鳞癌发生、发展中的作用机制及分子靶向治疗宫颈鳞癌奠定实验研究基础。方法:(1)收集2017年12月至2018年11月于江苏大学附属医院妇科诊治的29例子宫颈鳞癌患者宫颈组织(子宫颈鳞癌组)和27例因妇科良性肿瘤行全子宫切除术者宫颈组织(对照组);应用实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术以及免疫组织化学方法(immunohistochemistry)检测宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织中FLCN mRNA及蛋白的表达水平。(2)采用脂质体转染法,分别将NC siRNA、FLCN siRNA-1703和FLCN siRNA-630按预设浓度对宫颈鳞癌SiHa细胞进行转染,于显微镜下观察各组细胞生长情况;qRT-PCR检测不同敲减组FLCN mRNA水平,挑选最适浓度的siRNA片段进行后续试验。(3)采用脂质体转染法,将空白质粒、FLCN-eGFP质粒对宫颈鳞癌SiHa细胞进行转染,于显微镜下观察各组细胞生长情况;应用qRT-PCR和细胞免疫荧光技术检测不同转染处理后细胞系中FLCN mRNA和蛋白水平。(4)采用CCK-8法检测各组细胞增殖活力,采用TUNEL和磷酸化组蛋白H3(PH3)染色观察各组细胞凋亡和增殖情况。结果:(1)与对照组相比,宫颈鳞癌组中FLCN mRNA和蛋白表达水平表达均显著降低(P均<0.05)。(2)qRT-PCR结果显示,与对照组相比,各siRNA转染组FLCN mRNA相对表达水平均有不同程度的下调。FLCN siRNA-630在50 nmol/L浓度下干扰效果最好,可下调约70%。因此,本文选择在SiHa细胞中转染50 nmol/L FLCN siRNA-630进行后续实验。(3)转染FLCN-eGFP质粒48 h后,FLCN mRNA表达较空白对照组显著升高,细胞免疫荧光染色后通过荧光显微镜的检测,转染FLCN-eGFP后有较多的绿色荧光信号,证明FLCN基因确实转染进入SIHA细胞中,通过统计发现转染效率大约为40%(P<0.01)。(4)与阴性对照组相比,FLCN siRNA-630组,PH3蛋白阳性比例增加[(6.24±1.20)vs(0.85±0.05),P<0.05],TUNEL阳性细胞比例减少[0.02±0.02)vs(4.80±0.92),P<0.01],提示细胞增殖增强、凋亡减弱。(5)与空白对照组相比,FLCN过表达组细胞增殖活力减弱,SiHa细胞中PH3蛋白阳性细胞比例减少[(0.67±0.11)vs(7.64±0.55),P<0.01],TUNEL阳性细胞比例增加[(57.10±0.96)vs(0.03±0.03),P<0.001],提示细胞增殖减弱、凋亡增强。结论:(1)FLCN基因在宫颈鳞癌组织中低表达;(2)FLCN基因可抑制SiHa细胞增殖并促进其凋亡。