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研究背景:乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染导致的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占所有肝癌的87.5%,是我国肿瘤导致死亡的重要原因之一。乙肝病毒感染所致的肝癌(HBV-HCC)在发病率和死亡率上表现出明显的性别差异,男女比例约为6.7:1,应用环境暴露的差异无法解释这一现象,研究表明性激素及其受体是肝癌发生性别差异的重要原因,雄激素受体(androgen receptor,AR)发挥促癌作用,雌激素受体(estrogen receptor,ER)发挥抑癌作用。乙肝病毒慢性致癌的过程中AR与HBV产生交互作用,AR与免疫炎症分子相互作用维持了慢性炎症,破坏了载脂蛋白B m RNA编辑多肽3家族(apolipoprotein B m RNA editing enzyme catalytic polypeptide 3,APOBECE3)和DNA葡萄糖基转移酶(uracil DNA glycosylase,UNG)的平衡,促进了体细胞变异的产生和HBV整合的发生,同时还和雄激素相互作用,改变了关键信号通路和生存优势。本研究主要探究AR对体细胞突变以及与HBV整合这两类关键突变之间的相互关系。体细胞变异是HCC进化的基础,APOBEC3家族是诱导体细胞突变和病毒突变的重要分子,可以通过脱氨基活性,造成人体和病毒基因组损伤,目前尚缺APOBEC3家族基因与AR之间的作用关系的研究。HBV整合是HBV-HCC特有的突变类型,也是HBV直接损伤人体基因组的方式,端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)被证实为常见的HBV整合基因,HBV整合插入TERT片段的功能以及AR对其作用也尚待研究。研究目的:HBV-HCC具有明显的性别差异,提示AR在HCC进化过程中有显著作用,研究从APOBEC-UNG失衡以及HBV整合突变两个方面入手,解释AR通过与体细胞突变因素交互作用进而影响HCC进化的作用。研究方法:1.利用公共数据库信息,评估AR/ER以及性别差异对预后的影响,构建AR/ER过表达的肝癌和正常肝细胞系,观察在雄激素(DHT)、雌激素(E2)和雄激素受体抑制剂(FLU)刺激作用下细胞增殖情况。2.分析AR与APOBEC家族基因相关性,并在过表达AR/ER细胞系中研究AR对APOBEC家族基因和UNG平衡关系中起的作用。3.通过建立小型预后队列,进行转录组测序验证生物信息分析结果,同时进行捕获测序探索与AR功能相关的关键HBV整合突变,并在AR过表达细胞系中研究AR对HBV高频整合突变的协同作用。4.构建PDX整合小鼠模型、去势小鼠模型、AR过表达小鼠模型和AID-UNG失衡小鼠模型,探究激素和其受体在肿瘤形成中发挥的作用。研究结果:1.AR对HCC患者预后和HCC细胞增殖能力的影响在GSE14520队列和TCGA-LIHC队列中分析性别差异和AR/ER对HBV-HCC预后的影响,发现在GSE14520队列中不同性别与预后差异显著差异,提示男性HCC预后不良(P=0.0467);TCGA-LIHC队列中性别差异与HCC预后均无统计学意义。TCGA-LIHC队列癌组织中以及非HBV感染者人群中AR低表达提示HCC预后不良(P=0.0045,P=0.0058),在TCGA-LIHC队列HBV感染者中以及GSE14520队列中女性肿瘤患者中,AR高表达与HCC预后不良存在边缘性统计学意义(P=0.0863,P=0.065)。在TCGA-LIHC队列及其肿瘤和癌旁样本中,ER低表达提示HCC预后不良(P=0.0202,P=0.0358,P=0.0108);GSE14520队列中ER低表达与HCC预后不良存在边缘性统计学意义(P=0.0572),在其肿瘤样本中ER高表达提示HCC预后不良(P=0.0234),在其癌旁样本中ER与HCC预后无统计学意义(P=0.4327)。成功构建了过表达AR/ER细胞系(Hep G2/L02),在激素作用下进行细胞增殖实验,结果发现:单独添加雄激素刺激对Hep G2/L02细胞增殖没有明显的促进作用,单独添加雌激素刺激对L02细胞增殖有显著促进作用(P<0.001),上调雄激素受体水平并施加雄激素刺激对细胞增殖有显著的促进作用(Hep G2,P=0.019;L02,P=0.009);在未处理细胞系中施加雄激素受体拮抗剂可以显著抑制细胞生长(P<0.001),过表达AR可以拮抗雄激素受体抑制剂的效果。结果表明:过表达AR能够促进HCC的增长,并且维持一定的AR基础水平是HCC增殖的必要条件。2.AR促进APOBEC3家族和UNG表达AR对于肝癌细胞中APOBEC3家族具体亚型表达上有差异,蛋白质和m RNA水平均有升高的是APOBEC3A和APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D和UNG,过表达AR使正常肝细胞中表达水平升高的是APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G和APOBEC3H;雄激素作用下,过表达AR的肝癌细胞在APOBEC3A的表达量上有显著升高,正常肝细胞在APOBEC3A和UNG的表达量上有显著升高。ER对于肝癌细胞中APOBEC3B和UNG表达量有抑制作用,而APOBEC3A、APOBEC3C、APOBEC3D表达升高,正常肝细胞中APOBEC3B、APOBEC3D和UNG表达量升高;雌激素作用下过表达ER的肝癌细胞在UNG的表达量上显著下降,正常肝细胞在APOBEC3A表达量上有显著升高。3.AR与APOBEC3家族基因的相关性及预后分析在TCGA-LIHC队列中,相关分析显示AR与APOBEC3D、APOBEC3G和APOBEC3H呈显著负相关(P=0.005,P=0.021,P=0.01)。预后分析显示:TCGA-LIHC队列癌症组织中发现,APOBEC3B高表达提示HCC患者预后不良(P=0.0305),APOBEC3G和APOBEC3H低表达提示HCC患者预后不良(P=0.0033,P=0.0037);TCGA-LIHC队列中HBV感染者人群中,HBV感染者癌症组织中APOBEC3A、APOBEC3B高表达提示HCC患者预后不良(P=0.0137,P=0.0017),APOBEC3H低表达提示HCC患者预后不良(P=0.0388);非HBV感染者人群癌症组织中APOBEC3B、UNG高表达提示HCC患者预后不良(P=0.0472,P=0.0008);在全部为HBV感染者的GSE14520队列肿瘤样本的预后分析,表明APOBEC3A、UNG的高表达提示HCC预后不良(P=0.0283,P=0.009),APOBEC3C低表达提示HCC预后不良(P=0.0304)。4.HCC组织中HBV整合高频突变及其与AR的协同作用通过HBV捕获测序确定HCC组织中最频繁的整合突变区域为TERT上游。发现TERT整合存在多样性,其中HBV X片段整合频率最高,说明HBV X片段是整合入人体基因组的主要片段,同时部分P区、S区和C区均有整合,经Sanger测序确定,实际整合片段长短高于二代测序结果。在DNA水平,TERT的HBV整合突变检测率最高(16%),并且全部分布在启动子区,TERT启动子区的HBV整合与TERT基因在癌症组织中的表达升高有关。HBV片段插入TERT整合的功能验证。HBV各个区插入对TERT启动子功能都有影响,其中在TERT启动子插入的P区(Pro-P1)最为显著。Pro-P1区整合的TERT启动子片段的功能活性是其他整合型启动子的20-5000倍,其他启动子区插入片段,例如启动子区插入的X区(Pro-X)、反向插入的X区(Pro-Xr)和启动子插入的S区(Pro-S)插入片段在荧光表达量上比对照高出了3-7倍;在启动子上游插入的X区(Up-X)及其反向插入(Up-Xr)片段相对于启动子上游对照片段(Up-co)高表达约15倍和35倍;插入在启动子前区的Pre S(Prepro-Pre S)片段表达量比对照片段低了50倍,Prepro-S和Prepro-X比对照高出2-3倍;插入增强子的片段中,增强子区插入的P区(Enhancer-P)功能活性是对照的600倍左右,增强子区的其他插入片段(Enhancer-Pre S、Enhancer-S1、Enhancer-S2、Enhancer-P2、Enhancer-X和Enhancer-Xr)荧光强度高表达于对照片段的10-30倍不等。加入雄激素刺激后,TERT非整合片段(TERT-co)受到影响,功能活性升高2倍;整合片段中启动子区插入的P区(Pro-P1)、HBX反向插入(Pro-Xr)片段和S片段(Pro-S)受到影响,其中Pro-P1片段功能活性升高了1.2倍,Pro-Xr片段的功能活性升高了2倍,Pro-S片段功能活性下调了9倍。说明AR与雄激素结合对于TERT-co、Pro-P1、Pro-Xr片段有正向调节作用,对Pro-S有着反向调节的功能。在过表达细胞系敲除AR后,Pro-P1插入片段的功能活性下调了1.38倍,Pro-X区插入片段升高了2.11倍,Pro-Xr插入片段升高了7倍,表明Pro-P1受到AR的正向调节,AR对Pro-X区和Pro-Xr有负向调节作用。5.TERT表达量与HCC的预后分析及其与端粒长度之间的关系TCGA-LIHC队列中TERT低表达提示预后不良(P=0.0406),进一步筛选出HBV感染者,同样TERT低表达提示HCC预后不良(P=0.034);与之截然相反的是,在HBV非感染者人群中TERT高表达提示HCC预后不良(P=0.0069)。癌和癌旁样本端粒长度测量,发现癌旁端粒长度显著大于肿瘤样本的端粒长度(P<0.05),无TERT整合与有整合的样本的端粒长度无统计学差异。研究结论:1.性别差异及AR/ER表达水平可以影响HCC患者预后。男性提示预后不良;AR与预后的关系受到性别、HBV感染等因素的影响,比如AR在TCGA-LIHC队列中非HBV感染人群中是危险因素,而在TCGA-LIHC队列的HBV感染人群和GSE14520队列的女性中就是保护因素;ER低表达提示预后不良。AR/ER对预后的影响可能是与激素水平有关。2.过表达AR并添加雄激素可促进肝(癌)细胞增殖,且维持一定的AR水平是肝(癌)细胞增殖的必要条件;单纯添加雌激素可促进肝细胞增殖,提示激素对癌与非癌促进增殖的机制有所差异。3.AR可以调控APOBEC3家族基因表达,在肝癌细胞和肝细胞高表达的亚型存在互斥现象,仅有APOBEC3D重叠,提示不同组织中APOBEC3亚型存在表达差异;AR和雄激素结合后可进一步促进APOBEC3A的表达量,而ER在和雌激素结合后下调了APOBEC制衡分子UNG的表达量,提示了AR促癌和ER抑癌的作用有所差别。4.发现APOBEC3家族基因与AR表达量之间的相关性,初步确认他们之间的密切联系;APOBEC3家族基因表达水平可对HCC患者预后产生影响,尤其是APOBEC3A高表达和APOBEC3G的低表达在HBV感染导致的HCC中与患者预后不良相关,提示其与HBV相互作用导致癌症发生。5.TERT是HCC的高频整合位点,HBV插入TERT启动子的P区发挥作用最为显著,AR结合雄激素对部分整合插入片段产生了调控作用,是AR促进整合突变致癌的原因之一。