论文部分内容阅读
美国癌症研究所和世界癌症研究中心最新报道指出：经常食用十字花科蔬菜对预防癌症的发生起到非常重要的作用,由于十字花科植物中含有膳食性的异硫氰酸衍生物-芥子油苷,目前已鉴定的有120多种,其中4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷也称为萝卜硫苷(glucoraphanin)的水解产物萝卜硫素(sulforaphane)既可以作为抗氧化剂也可以激活消除致癌物质基因的表达,从而有效的降低癌症的发生率,是迄今为止植物中发现的最为有效的抗癌成分。萝卜硫素在芸薹属作物西兰花(尤其是幼苗)中的含量相对较多,此外,西兰花中的维生素、蛋白质、微量元素等成分也远远高于其他蔬菜,有“蔬菜之王”的美称,深受中西方饮食的偏爱。因此,利用转基因技术进一步提高西兰花中萝卜硫素的含量,从而将西兰花培育成辅助癌症治疗的“功能蔬菜”对于科研和医学方面都具有重要的理论和实际意义。本文以西兰花为实验材料,建立了有效的西兰花遗传转化体系并以萝卜硫苷合成关键酶基因CYP79F1为目的基因构建了35S::CYP79F1植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入西兰花受体细胞中。同时,我们采用PCR及RT-PCR技术在CYP79F1基因的检测与表达水平上进行了分析,并通过高效液相色谱法(HPLC)对转基因西兰花植株进行了芥子油苷种类与含量的检测和鉴定。实验主要研究结果如下：1.植物表达载体的构建以pCAMBIA330035Su为基础质粒,筛选标记基因选择磷酸新霉素转移酶基因(nptⅡ),利用CaMV35s启动子驱动芥子油苷合成关键酶基因CYP79F1的表达。2.农杆菌介导西兰花遗传转化体系的建立“青秀”西兰花最适合的外植体是下胚轴,在3mg·L-16-BA和0.1mg·L-1NAA的组合中,不定芽分化率高达83.33%,下胚轴经过2-3天的预培养可以提高抗性愈伤率,农杆菌的最适侵染浓度为OD600为0.5时稀释20倍,卡那霉素的最佳筛选浓度为10mg·L-1,利用该遗传转化体系在组织培养技术的基础上成功获得了过量表达CYP79F1基因的西兰花植株。3.转基因植株分子生物学检测本次实验共获得西兰花抗性植株为22株。其中,PCR检测阳性植株为3株,以该阳性植株为供试材料进行RT-PCR检测,均呈阳性,初步表明CYP79F1基因已经整合到西兰花基因组中。4.转基因西兰花芥子油苷含量检测与鉴定利用HPLC对过量表达CYP79F1基因的西兰花植株进行芥子油苷含量的测定,分析转化植株中短链脂肪组芥子油苷尤其4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷(萝卜硫苷)含量变化情况。结果表明,转CYP79F1基因西兰花植株中萝卜硫苷的含量与野生型相比有明显的增加。