采用流式细胞术分析过敏性休克大鼠嗜碱性粒细胞活化试验

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目的应用流式细胞术(FCM)检测过敏性休克大鼠血中嗜碱性粒细胞CD63的表达,确定过敏性休克时嗜碱性粒细胞的活化情况,探讨FCM及嗜碱性粒细胞活化试验(BAT)在过敏性休克诊断中的应用价值。方法40只Wistar-Hokkaido大鼠,雌雄不限,体重200~220g。将40只大鼠随机分为对照组和实验组,实验组包括致敏不激发组、过敏性休克死亡组、过敏性休克死后12h组、过敏性休克死后24h组,每组8只。采用卵蛋白腹腔注射建立过敏性休克大鼠动物模型,在休克死亡后的不同时间点提取各组大鼠右心室血及其肺组织。用三色免疫荧光标记流式细胞技术和CD63/CD45/CD203c组合抗体检测各组大鼠血嗜碱性粒细胞活化情况。以CD45和CD203c联合设门,CD63作为嗜碱性粒细胞活化标志物,检测各组大鼠血液中嗜碱性粒细胞表面CD63表达率,以代表各组大鼠血嗜碱性粒细胞的活化情况。提取的肺组织于10%的中性甲醛固定,石蜡切片,常规HE染色,并采用免疫荧光染色法观察各组大鼠肺组织CD63的表达情况,BI-2000病理图像分析仪对图像进行分析,并采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。结果(1)过敏性休克死亡组CD63的表达率为17.341±2.044%,休克死亡后12h组CD63的表达率为13.631±2.199%,休克死亡后24h组CD63的表达率为12.236±1.646,对照组CD63表达率为1.423±0.383%,致敏不激发组CD63表达率为1.465±0.337%。结果表明,过敏性休克死亡组、休克死亡后12h组、休克死亡后24h组CD63的表达率均明显高于对照组(P=0.000,P<0.01),其差异具有统计学意义。致敏不激发组与对照组相比,结果没有显著性差异。而实验组中休克死亡组CD63表达率最高,随着死后经过时间的延长CD63的表达率逐渐降低。(2)免疫荧光染色法在显微镜下观察到CD63的阳性染色为绿色,观察到过敏性休克组都有CD63的表达,说明嗜碱性粒细胞发生活化,且随着时间的延长,阳性染色逐渐减少。结论(1)大鼠过敏性休克时血嗜碱性粒细胞存在异常活化。(2)CD63可作为I型过敏反应中嗜碱性粒细胞特异性激活标志物,为过敏性疾病的诊断提供辅助的检测指标。(3)嗜碱性粒细胞活化试验有望作为过敏反应体内试验的补充,为临床诊断及法医学鉴定过敏性休克提供新的方法和途径。
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