紫苏4-羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的克隆及分析

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本实验以唇形科植物紫苏(Perilla frutescens)为研究对象,首次从紫苏中克隆得到了迷迭香酸合成途径中的旁路基因4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(4-Hydroxyphenlpyruvate Dioxygenase,HPPD)基因的cDNA和基因组DNA序列全长以及启动子序列,全长cDNA命名为PerHPPD(GenBank登录号:KC762747.1),并对该基因进行了生物信息学分析和基因表达分析,为深入研究迷迭香酸的次生代谢机制和改善紫苏的种质资源提供了有力的理论基础和实践依据。通过已报道的唇形科植物彩叶草和丹参的HPPD基因序列比对,在保守序列区域设计简并引物,利用PCR技术扩增得到HPPD基因的部分序列片段,然后再利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到1636bp的cDNA全长,其中包含1434bp的开放阅读框(ORF),编码477个氨基酸残基,含有长度为22bp的5’非编码区(5’UTR)和180bp的3’非编码区(3’UTR)。并设计全长引物克隆得到该cDNA序列对应的DNA序列全长2876bp,包含两个外显子,一个内含子。外显子在序列中的位置为1-1248bp和2610-2876bp,内含子的位置为1249-2609bp。经BLAST基因比对,得到的PerHPPD基因的cDNA全长序列与其它物种中报道的HPPD基因具有很高的相似性,与丹参(Salvia miltiorrhiza)和彩叶草(Solenoatemon scutellarioides)核苷酸的一致性为81.22%和85.93%,编码的氨基酸的一致性为70.98%和75.62%。利用生物信息学软件对克隆得到的紫苏PerHPPD基因进行分析,结果表明:其编码的氨基酸表现为亲水性,是一个亲水蛋白;不具有跨膜结构域。紫苏HPPD蛋白的二级结构预测显示其含有21.59%的α螺旋,21.17%的延伸链,8.39%的p折叠,48.85%的无规则卷曲。对其高级结构进行预测,得到了紫苏HPPD蛋白的三维结构模型。HPPD系统进化树分析表明HPPD基因有明显的种属特性,且紫苏HPPD基因与唇形科植物HPPD基因亲缘关系最近。采用基因组步移方法,经PCR扩增得到了长度为1953bp的紫苏HPPD基因5’侧翼序列(启动子区域),并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析,结果显示紫苏HPPD基因启动子调控区域有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸应答顺式作用元件、茉莉酸甲酯调控顺式作用元件、赤霉素应答顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件,且富含TATA-box和CAAT-box。以紫苏β-Actin基因作内参,采用荧光实时定量PCR方法对HPPD基因表达进行分析,结果表明紫苏HPPD基因在叶中的表达丰度最高,茎中次之,根中最低且500μmol/L MeJA、100μmol/L ABA和250mg/L的赤霉素在一定程度上均上调紫苏HPPD基因的相对表达水平。
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