MicroRNA(miRNA)是近年来备受关注的一类普遍存在于动、植物中的非编码小RNA,大约20-24个核苷酸,来自于长的转录子前体pri-miRNA和pre-miRNA。MiRNA与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)不完全互补结合,在多细胞生物体中,转录后调控基因的表达,影响着几乎所有的信号通路,参与多种生理病理过程,在肿瘤的发生和发展中也发挥了重要的调节作用。目前研究最为清楚的Ras相关单体GTP酶家族为Rho, Racl和CDC42,它们参与细胞内多样的调节作用,包括细胞骨架的重构,细胞的迁移和侵袭。Rho相关的丝／苏蛋白激酶(Rho-associated serine/threonine protein kinase,Rock)是迄今为止功能研究最为清楚的Rho下游靶效应分子之。活化的GTP·Rho可以和Rock相互作用而激活Rock。通过与Rho相互作用,Rock在肿瘤细胞的转移过程中参与调控细胞迁移和侵袭。肿瘤的侵袭和转移是世界上癌症患者死亡最常见的原因。最近,越来越多的研究报道表明,miRNA与肿瘤细胞的侵袭和转移有关,其调控肿瘤细胞侵袭和转移的作用机制成为miRNA研究领域的热点之一。在miRNA与Rho/Rock-1传导通路的关系中,Kong等人在鼠正常乳腺上皮细胞中发现,miR-155在TGF-β诱导的上皮间质转化以及RhoA引起的细胞迁移侵袭过程中具有重要作用。TWISTl能够诱导miR-1Ob, miR-1Ob通过直接转录后抑制HOXD 10的表达来间接的增加RhoC的水平,从而影响了肿瘤细胞的迁移和侵袭。研究Rho和miRNAs之间的关系加强了miRNA在肿瘤形成中的重要性,并且为癌症转移的患者提供了新的治疗策略。miR-125a是一种功能以及机制尚未研究清楚的miRNAs之一。Yanainhara等人发现miR-125a定位在19q13.41,并用miRNA芯片分析了104对肺癌组织以及相应的癌旁肺组织,发现与癌旁肺组织相比较,miR-125a在肺癌组织中下调表达。至目前为止,已发现的成熟体miR-125a家族有两个成员,即hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p。本研究目的旨在探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织中hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达及其临床意义,分析hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p与NSCLC细胞系转移潜能的关系。并在细胞水平上,通过向肺癌细胞中转染正义和反义的2’-O-甲基寡核苷酸的方法,探讨增加hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达以及下调hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达对Rho/Rockl途径,以及肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,为hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p可能是Rho/Rockl信号通路非常重要的调节因子提供依据。材料与方法1、NSCLC组织标本52例配对的非小细胞肺癌和癌旁肺组织(远离原发灶)标本均来自中国医科大学病理教研室。患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色,分别由两名病理诊断医师,根绝WHO肺及肺膜肿瘤分类标准(2004)和TNM分期系统(1997),确定肿瘤的组织学分型以及临床病理分期。52例NSCLC包括：男性33例,女性29例；年龄40～78岁(平均58岁±9岁)；鳞癌22例,腺癌30例；病理分级,高分化8例,中分化28例,低分化16例；病理分期,Ⅰ期18例,Ⅱ期15例,Ⅲ期19例；淋巴结转移20例,无淋巴结转移32例。52例配对组织在液氮中快速冰冻,以后用于提取mRNA。常规病理检查手术切除的肺门、纵膈以及肺内淋巴结,用于确定肺癌的淋巴结转移情况。患者的临床病理参数包括性别,年龄,组织学类型,病理分级,病理分期,淋巴结转移,摘自患者的病历资料。2、细胞培养冻存于液氮的A549细胞经复苏后,用DMEM培养液(含有10%新生牛血清,100μ／ml的青霉素(?)100μg/ml的链霉素),在37℃,5%CO2饱和湿度条件下培养,经3次传代稳定后,进行转染。3、细胞转染2’-O-甲基寡核苷酸(2’-O-Me-sense-3p:5’-ACA GGU GAG GUU CUU GGG AGCC-3’2’-O-Me-antisense-3p:5’-GGC UCC CAA GAA CC U CAC CUGU-3’, 2’-O-Me-scramble-3p:5’-GGU CGG UGC UCG AUG CAG GUAA-3’, 2’-O-Me-sense-5p:5’-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UGA-3’, 2’-O-Me-antisense-5p:5’-UCA CAG GUU AAA GGG UCU CAG GGA-3’, 2’-O-Me-scramble-5p:5’-GGA CG G CGA UCA GAU AAG AGU UCU-3’.)用结合DNA技术合成(GeneChem, China)。用LipofetamineTM 2000 (Invitrogen, USA)将20gM 2’-O-甲基寡核苷酸转染入6孔板中A549和SPC细胞中为RNA提取和transwell备用。untreated为未加任何处理因素的细胞,scramble为转染乱码序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞,sense为转染正义序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞,antisense为转染反义序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞。其中对照组细胞为(untreated和scramble)。4、Real-time PCR根据操作说明应用TaqMan MicroRNA试剂检测成熟体miRNA (Applied Biosystems, USA)。所有的RT产物,在ABI Prism 7900HT序列检测系统中运行。用特异的RT引物和TaqMan探针定量检测hsa-miR-125a-3p (PN:4395310)和hsa-miR-125a-5p (PN:4395309), RNU6B (PN:4373381)和U18(PN:4380904)为内参。组织样本用2次独立样本经过2次独立实验,细胞样本用3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ=2-△△Ct的方法进行分析。5、RT-PCRTRIzol试剂提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度并定量,在1%甲醛变性凝胶电泳验证RNA完整性。RT-PCR采用两步法试剂盒(宝生物公司)按照厂家推荐步骤进行,扩增体系为20μl,以持家基因β-actin为内参照,对样品模板用量标准化。引物参照文献及使用Primer Designer5.0软件设计。RT条件按照厂家推荐,PCR条件：95℃lmin,随后进行35个循环的94℃30s,55℃30s,72℃45s,最后72℃充分延伸1Omin; p-actin PCR条件：94℃5min,随后94℃40s,50℃40s,72℃40s共35个循环,最后72℃充分延伸5min。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,UVP图像处理系统采集图像,ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。产物经1.75%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像,分析各条带强度。6、Western blot检测提取各组织蛋白,根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS—聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样量50μg,常规电泳、转膜、封闭,一抗及相应二抗37℃孵育1h,DAB显色,β-actin作为内对照。UVP图像处理系统采集图像,ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度。分别计算不同指标和P-actin的INT×S,用二者的比值显示不同指标的表达水平。7、Transwell细胞迁移和侵袭实验在具有8μm小孔聚碳酸酯滤膜的培养小室上铺用预冷无血清培养基稀释的Matrigel基质胶,接种100μl无血清培养基稀释的A549细胞或NCI-H460细胞(5×105个／mL),下室加入600μl含10%血清的DMEM培养液或1640培养液,每组设6复孔。37℃、5%CO2条件下培养24h后,取出培养小室,用2.5%戊二醛固定15min,并以0.5%Triton X-100处理3min,苏木精中染核15min。将培养小室倒置,在光学显微镜(Leica,德国)下观察、照相,并计数每高倍视野滤膜底面的平均细胞数。细胞迁移实验在无Matrigel基质胶包被的Transwell小室中进行,方法同细胞侵袭实验。8、统计学分析SPSS13.0用于所有的统计学分析。Real-time PCR结果数据即hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p在非小细胞肺癌及相应的癌旁肺组织中的表达水平经过log2转换。配对T检验用于分析两种成熟体miRNA-125a在非小细胞肺癌和癌旁肺组织中的显著差异。Chi-square检验(Chi-square test)和双侧fisher精确检验(Two-sided fisher’s exact test)用于分析hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达与临床病理因素的关系。Mann-whitney检验(Mann-whitney test)用于病理分级,病理分期等级资料的分析。Spearman相关分析(Spearmancorrelation analysis)用于分析hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p与病理分期和淋巴结转移的相关性。其它实验采用t检验。用mean±SD, p<0.05为有统计学意义。实验结果1、Hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p在非小细胞肺癌组织中表达下调与非小细胞肺癌淋巴结转移和病理分期有关。(1) hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p在非小细胞肺癌组织中的表达：real-time PCR检测52例非小细胞肺癌及相应的癌旁肺组织中hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p相对表达水平的结果显示,与癌旁肺组织相比较,52例非小细胞肺癌组织中,hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p表达下降(p＜0.05)。hsa-miR-125a-3p表达的平均水平降低约4.5倍(p<0.001), hsa-miR-125a-5p表达的平均水平下降近6倍(p＜0.001)。(2) hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p与临床病理因素的关系：根据hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p在52例非小细胞肺癌中表达的平均水平分别分成2组,即hsa-miR-125a-3p低表达(低于平均值1.2352,log2转换数据)和高表达组(高于平均值1.2352,log2转换数据),hsa-miR-125a-5p低表达(低于平均值1.8594,log2转换数据)和高表达组(高于平均值1.8594,log2转换数据)。统计学分析结果显示,hsa-miR-125a-3p表达与年龄(p=0.031)、病理分期(p=0.012)和淋巴结转移(p=0.034)有关,与性别、组织分型以及病理分级无关；hsa-miR-125a-5p与病理分期(p=0.002)和淋巴结转移(p=0.042)有关,与年龄、性别、组织分型以及病理分级无关。sepearman相关检验结果显示,hsa-miR-125a-3p表达与病理分期(r=-0.352,p=0.011)和淋巴结转移(r=-0.326,p=0.018)呈负相关,hsa-miR-125a-5p表达与病理分期(r=0.439,p=0.001)和淋巴结转移(r=0.300,p=0.031)呈正相关。2、hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p通过Rho/Rockl信号通路调控肺癌细胞的迁移和侵袭。(1)hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p在非小细胞肺癌细胞系中的表达：real-time PCR检测了4种肺癌细胞系LH7,A549,SPC-A-1和NCI-H460中hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达情况,人正常支气管上皮细胞(Human bronchiolar epithelium cell line, HBE)作为正常对照细胞系,U18作为内对照。结果显示,hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p在4种肺癌细胞系中的表达均低于HBE (p<0.01)。hsa-miR-125a-3p相对表达水平在NCI-H460细胞中表达最低,在A549细胞中呈中度表达(p<0.001), hsa-miR-125a-5p相对表达水平在A549细胞中表达最低,在SPC-A-1细胞中呈中度表达(p＜0.001)。(2)2’-O-甲基寡核苷酸对细胞内hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的影响：Real-time PCR的结果显示,转染正义2’-O-甲基寡核苷酸后,细胞内hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的含量明显增加(p＜0.001)；转染反义2’-O-甲基寡核苷酸后,细胞内hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p明显降低了(p＜0.001)。(3) hsa-miR-125a-3p对肺癌细胞迁移和侵袭的影响：hsa-miR-125a-3p的迁移实验显示,A549细胞的穿膜细胞数在未处理组细胞中是34.40±2.47个,与未处理组细胞相比较,转染乱序组细胞的穿膜细胞数没有明显改变(34.40±2.38,p=1.000),转染sense-3p组细胞的穿膜细胞数明显降低(25.33±3.15,p＜0.001),转染antisen-3p组细胞的穿膜细胞数明显增加(48.80±2.65, p< 0.001)。hsa-miR-125a-3p的侵袭实验显示,A549细胞侵过基质胶的穿膜细胞数在未处理组细胞中是24.33±2.06。与未处理组细胞相比较,转染乱序组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数没有明显改变(24.00±2.54,p=0.696),转染sense-3p组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数明显降低(11.13±1.60,p＜0.001),转染antisen-3p组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数明显增加(34.80±2.88,p＜0.001)。(4) hsa-miR-125a-5p对肺癌细胞迁移和侵袭的影响：hsa-miR-125a-5p的迁移实验显示,SPC-A-1细胞的穿膜细胞数在未处理组细胞中是24.20±1.78个,与未处理组细胞相比较,转染乱序组细胞的穿膜细胞数没有明显改变(28.80±2.70,p=0.445),转染sense-5p组细胞的穿膜细胞数明显增加(45.27±2.71,p＜0.001),转染antisen-5p组细胞的穿膜细胞数明显降低(16.93±3.24, p<0.001)。hsa-miR-125a-5p的侵袭实验显示,SPC-A-1细胞侵过基质胶的穿膜细胞数在未处理组细胞中是24.20±1.78。与未处理组细胞相比较,转染乱序组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数没有明显改变(23.80±2.00,p=0.568),转染sense-5p组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数明显增加(35.80±1.74,p＜0.001),转染antisen-5p组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数明显降低(17.47±2.07,p＜0.001)。(5) hsa-miR-125a-3p靶基因的预测和确认：用microrna.org和Target ScanHuman 5.1预测靶基因的网络数据库,对在细胞迁移和侵袭中起作用的潜在靶基因进行了预测。在候选基因调查中,我们发现RhoA基因的3’UTR包含2个高保守区域,分别由miRanda和TargetScan算法计算得到的,这两个高保守区域可能为hsa-miR-125a-3p与靶基因的作用连接位点。(6) Hsa-miR-125a-3p通过靶基因RhoA调控Rho/Rockl信号途径：Western blotting和RT-PCR分析显示RhoA蛋白在转染sense-3p细胞中明显减少(p=0.001),在转染antisense-3p细胞中明显增多(p＜0.001),而RhoA mRNA(p=0.482)变化并不是很明显。如预期的那样,Rockl蛋白和mRNA在转染sense-3p细胞中明显减少(p＜0.05),在转染antisense-3p细胞中明显增多(p＜0.05)。为了进一步说明RhoA是hsa-miR-125a-3p的潜在靶基因,我们转染了包含RhoA基因3’UTR全长的荧光素酶报告基因。三次结果显示,增加细胞内hsa-miR-125a-3p含量能够降低荧光素酶活性(p＜0.001)。这些结果表明hsa-miR-125a-3p可直接通过抑制靶基因RhoA而抑制细胞迁移和侵袭。在A549细胞中用Rho抑制剂CT04(最终浓度2.0μg／ml)阻断Rho,与未处理组相比较,迁移和侵袭的细胞数量在用CT04处理后明显减少(p＜0.001)。与阻断Rho未转染组相比较,转染sense-3p组或转染antisense-3p组细胞数目并没有明显的减少或增加(p＞0.05)。结果表明hsa-miR-125a-3p可能通过调控Rho/Rockl途径而影响细胞的迁移和侵袭。(7) Hsa-miR-125a-5p通过RhoC调控Rho/Rockl信号途径：Western blotting和RT-PCR分析显示RhoA蛋白(p=0.001)在sense-5p和antisense-5p转染细胞中都没有明显变化,RhoA mRNA (p=0.482)变化亦不是很明显。然而,RhoC mRNA和蛋白在转染sense-5p细胞中明显增加(p＜0.05),在转染antisense-5p细胞中明显减少(p＜0.05)。如预期的那样,Rockl蛋白和mRNA在转染sense-5p中明显增加(p＜0.01),在转染antisense-5p细胞中明显减少(p＜0.01)。在SPC-A-1细胞中用Rho抑制剂CT04(最终浓度2.0μg/ml)阻断Rho,与未处理组相比较,迁移和侵袭的细胞数量在用CT04处理后明显减少(p＜0.001)。与阻断Rho未转染组相比较,转染sense-5p组或转染antisense-5p组细胞数目也并没有明显的增加或减少(p＞0.05)。结果表明hsa-miR-125a-5p可能通过调控Rho/Rockl途径而影响细胞的迁移和侵袭。结论1、hsa-miR-125a-3p与病理分期和淋巴结转移呈负相关,而hsa-miR-125a-5p与病理分期和淋巴结转移呈正相关。2、hsa-miR-125a-3p能够通过Rho A/Rockl信号途径抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。3、hsa-miR-125a-5p能够通过RhoC/Rockl信号途径促进肺癌细胞的迁移和侵袭。