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漆酶(laccase,EC 1.10.3.2),又名对苯二酚:氧化还原酶(benzenediol:oxygen oxidoreductase),是指一类含铜的多酚氧化酶,其在环境污染物生物修复、生物能源生产、化合物合成及生物检测等领域有广阔的应用潜力。本论文以白腐菌——血红密孔菌Pycnoporus sanguineus MX5为漆酶生产菌株,研究了其发酵产酶条件、粗酶液的分离纯化、纯酶液的酶学性质以及其对染料的脱色能力,目的是为了探索未知的真菌漆酶种类,并发现其潜在的工业应用潜力。全文的主要结论如下:分别通过添加诱导剂、表面活性剂及真菌共培养这3种方式,对P.sanguineus MX5液态发酵产漆酶的条件进行了部分优化,首先设置不同的浓度梯度,接着采用多重比较进行统计分析,最终发现邻甲苯胺、吐温80、Gongronella sp.w5的接种量(v/v)分别为0.006%、0.04%和2%时,其诱导效果最好,达到顶峰时的漆酶产量分别为20980.55、12724.07和9389.81 U/L,较对照提高36.25%、119.93%和42.13%。经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE FF离子交换层析和Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析,分离得到3个漆酶同工酶Lac1、Lac2、Lac3,总的漆酶回收率为5.21%,其中Lac1达到2.01%,纯化倍数为3.49,Lac2达到1.29%,纯化倍数为2.93倍,Lac3达到1.92%,纯化倍数为0.86倍。经酶谱分析,它们均为单体蛋白,表观分子量分别为61.8、61.8和60.6 k Da,且三者在330 nm左右处有明显的特征吸收峰。通过Nano LC-MS/MS蛋白鉴定技术及氨基酸序列分析,它们均为血红密孔菌漆酶。这3个漆酶同工酶的最适反应p H值呈偏酸性(2.5-5.0),且反应温度范围较宽,在高温和低温环境下均有一定的催化活性;在中性条件下具有良好的p H稳定性,同时表现出一定的热稳定性,其中以Lac3的p H及热稳定性最为优异。漆酶催化底物广泛,本文中ABTS是最适底物,以ABTS为底物时,Km值分别为0.0093、0.0143和0.0230 mmol/L,Kcat/Km值分别为64343.43、38586.04和4148.67 S-1·m M-1。Fe2+能够强烈地抑制漆酶活力,而低浓度的Na+、Mn2+、Cu2+、Zn2+则稍有促进作用;抑制剂SDS、β-ME、L-半胱氨酸、DTT、Na F对漆酶有强烈的抑制效果,而螯合剂EDTA-2Na的抑制作用相对较弱。对P.sanguineus MX5漆酶在工业染料的脱色方面进行了研究,实验结果显示RB亮蓝(蒽醌类)、酸性红1(偶氮类)和活性黑5(偶氮类)是P.sanguineus MX5漆酶的反应底物,在没有介体ABTS存在的情况下也能催化染料的脱色,介体ABTS的加入有助于提高染料的脱色率,其中对酸性红1(偶氮类)的提升效果最好,反应180 min后,Lac1、Lac2、Lac3和粗酶液对染料AR1的脱色率分别达到65.33%、70.04%、70.09%和69.84%;而结晶紫(三苯甲烷类)以及中性红(杂环类)不是P.sanguineus MX5漆酶的直接作用底物,只有在添加介体ABTS后才能脱色这两种染料。其中,漆酶对中性红的脱色效果较差,只有Lac3和粗酶液对该染料有一定的脱色作用。总的来看,LMS对染料脱色能力的大小顺序为酸性红1>结晶紫>活性黑5>RB亮蓝>中性红。