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目的:卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）作为目前唯一广泛应用于临床预防结核病（tuberculosis,TB）的疫苗,其保护力随年龄增长呈下降趋势,尤其对预防成人TB效果不佳。鉴于我国BCG接种覆盖面广,研究BCG初免后的增强型TB疫苗迫在眉睫。我们根据结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）基因组不同基因在其特异性和致病性上的特点,选择M.tb原发感染阶段代表基因和差异区域基因进行重组载体构建及原核表达;同时设计融合蛋白,全序列合成及构建、表达。为验证该融合蛋白及其亚组分能否被中国M.tb感染者外周血T细胞所特异性识别,我们拟采用全血干扰素释放分析技术（Whole-blood IFN-y release assay,WBIA）检测M.tb感染者抗原特异性IFN-γ水平;为探讨同一类型佐剂中不同成分对免疫应答类型及水平的影响,我们拟首先建立基于Toll样受体激动剂的阳离子脂质体佐剂,与融合蛋白联用从而构建增强型亚单位TB疫苗;为评估相关疫苗的免疫原性,我们以其免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫应答的类型及水平,为提高其免疫保护力打下坚实基础。方法:1、选择M.tb分泌性抗原Rv1886c（Ag85B）和RD2抗原Rv1988,以此为基础设计构建并原核表达融合蛋白AR2及其亚组分蛋白,以Ni-NTA纯化后以SDS-PAGE电泳及Western blot进行鉴定。2、招募受试人群并以TB临床诊断标准对受试者进行区分,以WBIA测定AR2及其亚组分诱导不同人群外周血淋巴细胞产生的特异性IFN-γ水平及其差异。3、构建以阳离子脂质体DDA为基础、加入TLR4配体MPLA和/或TLR9配体CpG ODN的联合佐剂,以AR2联用不同佐剂构建新型亚单位疫苗。4、实验动物为SPF级C57BL/6小鼠,共分为5组进行皮下免疫:PBS组和BCG组（接种菌量为1.2×106CFU）仅免疫1次;BCG+AR2/DC组、BCG+AR2/DM组和BCG+AR2/DMC组在以BCG初免3周后,第3、6周各增强免疫1次（含蛋白 20μg）。5、小鼠经免疫9周后处死,收集其血清及脾细胞用于免疫原性分析,分别为:以ELISA检测及比较其抗原特异性抗体水平和脾细胞分泌细胞因子水平;以qRT-PCR检测肺组织细胞因子RNA水平;以流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测单阳和双阳的抗原特异性T淋巴细胞数量。结果:1、经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定,融合蛋白AR2及其亚组分重组蛋白成功构建并表达,且特异性及纯度较高。2、AR2及其亚组分蛋白均能刺激M tb感染者外周血T淋巴细胞产生较高水平的抗原特异性IFN-γ,且显著高于健康对照组（P<0.05）;AR2诱导产生的特异性IFN-y水平亦显著高于其亚组分蛋白刺激水平（P<0.05）。3、以BCG初免后,以融合蛋白亚单位疫苗诱导小鼠产生高水平的抗原特异性IgG及其亚类,IgG2a:IgG1比值大于1,提示其诱导的免疫应答趋向于Th1型细胞免疫。4、无论以PPD还是AR2刺激,BCG+AR2/DMC组诱导小鼠脾细胞产生的抗原特异性Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α水平均较其它组为高,初免增强组免疫小鼠肺脏IFN-γ、TNF-α和iNOS的mRNA表达水平均显著高于BCG组,尤以BCG+AR2/DMC组最高。5、初免增强组免疫小鼠诱导的IFN-γ+和TNF-α+单阳的CD4+T淋巴细胞数相较于BCG 组均高（P<0.05）,其中 BCG+AR2/DM 组 CD4+T 细胞数较 BCG+AR2/DC组有显著升高（P<0.05）,而BCG+AR2/DC组CD8+T细胞数较高（P<0.05）;BCG+AR2/DMC组产生的IFN-γ和TNF-α分泌型CD4十T和CD8+T淋巴细胞数均最高（P<0.05）。初免增强的3组中,IFN-γ+TNF-α+双阳的CD4+和CD8+T细胞数均显著高于BCG组,尤以BCG+AR2/DMC组CD4+T和CD8+T细胞数最高。结论:1、本课题所构建的融合蛋白AR2及其亚组分抗原均可诱导中国M.tb感染者产生高水平的抗原特异性IFN-γ,显著高于未感染人群,证实其可被中国M.tb感染者外周血T淋巴细胞特异性识别,且AR2诱导的IFN-γ水平显著高于亚组分抗原。2、以BCG初免、AR2联用不同佐剂增强方式免疫C57BL/6小鼠后,均诱导高水平的抗原特异性抗体及Th1型细胞因子。初免增强组的各项免疫原性指标较BCG组均显著升高,表明以融合蛋白AR2为基础构建亚单位疫苗的异源性增强策略,可诱导较强的CD4+Th1型细胞免疫应答,可以有效弥补BCG免疫保护力不足的缺点。3、在AR2联用基于阳离子脂质体的不同佐剂组进行免疫原性各项指标检测中,BCG+AR2/DMC组均高于疫苗联用单组分佐剂组,提示复合型佐剂DMC具有协同效应,可诱导更强的Th1型细胞免疫应答。4、本研究显示各初免增强组的抗原特异性IFN-γ+单阳、TNF-α+单阳和IFN-γ+TNF-α+双阳CD4+/CD8+T细胞数均较BCG组显著上升,可能是其免疫原性及免疫保护力提高的关键因素,而BCG+AR2/DMC组可能提供更高的免疫保护力。本课题研究为进一步探究AR2抗M.tb感染的保护性提供研究基础和依据,也为TB疫苗的异源性增强策略提供相关的理论和实验支持。图20;表10;参70;