咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)是茶叶中嘌呤碱的主体成份,对人体具有助消化、醒酒、提神等生理作用。因咖啡碱具有多种生理功能从而被广泛应用于医药、食品、化工等领域,这使得市场对咖啡碱的需求量增大;然而,因部分特殊人群(如幼龄儿童、孕妇、某些疾病患者等)摄入咖啡碱后会对人体产生一定的副作用,这又使低咖啡碱的茶叶产品市场需求越来越大。现市场上出售的咖啡碱大多是采用化学合成方法制备而来,这种方法存在附加产物多和污染环境的弊端。运用传统的低或高咖啡碱品种选育的方法又存在周期长,品种适制性下降的缺点。而从茶叶中直接提取或除去咖啡碱的方法,存在加工成本大,有害物容易残留以及茶叶品质受损的问题。因此,从长远来看这些方法都无法作为调控咖啡碱含量的有效方法。然而,基因工程技术具有培育周期缩短、成本较低、优质高产等特点,利用基因工程技术一方面通过构建工程菌可以实现体外生产咖啡碱;另一方面,研究咖啡碱生物合成过程中关键酶及其基因的生物学功能,可以实现对咖啡碱生物合成进行人工调控,为后续的基因改造和优化奠定基础。咖啡碱的生物合成途径主要包括四步反应:黄嘌呤核苷(XR)→7-甲基黄嘌呤核苷(7mXR)→7-甲基黄嘌呤(7-MX)→可可碱(Tb)→咖啡碱(Cf)。现有研究报道表明,咖啡碱生物合成途径中相关基因调控在咖啡中已基本完成,而在茶树中主要报道的是有关催化后两步反应的茶树咖啡碱合成酶TCS1,关于催化前两步反应的酶研究尚为空白。本文将对从茶树基因组文库中筛选出的N-甲基苷水解酶基因在大肠杆菌中进行表达分析,寻找具有催化咖啡碱合成途径中第二步脱核苷反应的N-甲基核苷水解酶,实现对咖啡碱的生物合成调控。主要研究结果如下:1.根据筛选出的N-甲基核苷水解酶基因,成功构建了重组表达载体pMAL-ST1、pMAL-ST2和pMAL-ST3。通过优化诱导条件得到最优的蛋白表达条件,结果显示融合蛋白在28℃8 h诱导情况下大部分以可溶性形式存在。对获得的融合蛋白进行体外酶活性分析,发现以XR为底物时,可以检测到表达蛋白pMAL-ST2和pMAL-ST3能够催化脱核糖反应,生成X;以XR和SAM为底物时,检测到表达蛋白pMAL-ST3能够催化生成7-甲基黄嘌呤(7-MX)。2.将重组质粒pMAL-CaXMT和pMAL-ST3分别经SalI/SbfI双酶切后,构建双基因融合表达载体pMAL-ST3-CaXMT。通过优化诱导条件得到融合蛋白在16℃20 h诱导情况下大部分以可溶性形式存在。对表达的融合蛋白进行体外酶活性分析发现,组合共表达载体pMAL-ST3-CaXMT产生的7-MX量增多,通过计算得出N-甲基核苷水解酶ST3活性比CaXMT活性略低。