能够诱导肿瘤细胞凋亡的物质，就有可能用于控制恶性肿瘤的生长。目前使用的大多数抗肿瘤药都有促肿瘤凋亡作用，人们在不断发现和研究更多的有促进凋亡的作用的化学物质，以期从中发现有临床应用价值的促凋亡抗肿瘤药。 已有大量文献报道有促凋亡作用的脂肪酸及含脂肪酸结构的物质，如短链脂肪酸类的丁酸；多不饱和脂肪酸类的DHA，EPA，花生四烯酸等；含脂肪酸结构的维甲酸等。我们研究的13—甲基肉豆蔻酸（13—MTD）是一种末端有甲基支链的十四碳烷基的中长链饱和脂肪酸。化学结构上与上述的脂肪酸类都不一样。2000年杨振华首次报道能引起多种肿瘤细胞的凋亡。并在裸鼠原位移植入的前列腺癌和肝癌的模型上证明其有较强的抗肿瘤作用。本课题研究13—MTD诱导人早幼粒细胞白血病HL60的凋亡作用，并进一步探讨这种凋亡作用的信号传导通路。 一．13—MTD的诱导ITL60细胞的凋亡作用 13—MTD抑制和杀灭HL60细胞的作用有明显的剂量依赖性，表现为低浓度时抑制生长作用，高浓度时能杀伤细胞，其IC₅₀为20.5μS／ml（药物处理24h）。其抑制和杀伤肿瘤细胞的特点是剂量范围比较窄，杀伤浓度与抑制浓度差别的倍数较小。在一低血清O．5％)的培养基中，牛血清白蛋白第五成分还能桔抗 13—MTD的抑制生长作用。随血清白蛋白浓度的增加这种桔抗作用也增强。 以 20Hg／ml的 13—MTD处理 HL60细胞，在 2～4 ，J＼时细胞形态发生明显改变，用 叶陡橙和滨乙锭双染的荧光显微镜观察，部分细胞裂解成膜完整的细胞小体。随后这些细胞就坏死。细胞涂片的Giemsa染色表明13－MTD处理8～12 ’J＼时，完整的细胞表面有小泡样出芽，胞浆内有大量的空泡，核染色质聚集改变。流式细胞仪检测表明在药物作用4～12小时有亚二倍体＊llbG；)期细胞存在，但对细胞周期的各期改变不明显。DNA的琼脂糖凝胶电泳表明DNA有特征性的“梯级”断裂。蛋白印迹检测在药物作用 3 ’J＼时后 Caspase刁蛋白，减少在 12小时检测到活性片段。这些都说明 13一 MTD能诱导细胞凋亡。通过对一些 13－MTD的衍生物和类似物的细胞毒性研究其构效关系，表明末端支链是 13－MTD的活性所必须的。烷基碳链长度超过18碳活性就减弱。而骏基的不同取代物对其话性有影响。 二．13－MTD对HL60细胞的Bax，BcIZ基因转录和表达的影响及对线粒体功能的影响 目前己知的促凋亡信号传导通路有两条。一条是药物通过与细胞受体CD95结合，激活胞内caspase－8及下游的Caspase级联反应，最终活化caspase上及其底物，使胞核DNA断裂。另一些药物包括VP－16，gw甲酸类，staurosporine，不饱和月肪酸类等。通过调控 Bcl－2家族基因的表达，触发线粒体释放内外膜间的细胞色素CKyt七)及其它促凋亡蛋白到胞浆中。Cyt七与 Apafl及 casppse习结合，活化caspase习，随后活化效应caspase酶与细胞受体通路的下游一样，最终使细胞凋亡。 我们的结果表明 13－MTD在处理细胞 10分钟内就能使线粒体跨膜电位显著降低，30分钟达高峰。持续2小时只有部分恢复。环抱菌素A不能抑制其作用，这说明不是通过线粒体渗透性膜孔通道开放引起的。线粒体跨膜电位改变发生在Bax和BclZ表达改变，Cyt七外流及DNA断裂之前。RTPCR方法检测 BclZ mRNA水平在药物作用 1’J’时后有明显下降，而蛋白表达在 2 ’J＼时后也明显减少；Bax ＂l．－－－－xA水平在药物作用1小时有明显升高，其蛋白表达Zh～4h增加明显。蛋白印记法检测药物处理的细胞浆的 Cyt七，表明 13－MTD所致线粒体 Cyt七外流 3 h～6 h增加，环泡菌素 A能抑制大部分 Cyt七的外流，可见 Cyt七外流与线粒体渗透性膜孔开放有关。然而在另一实验中，13－M＊能直接使游离大鼠线粒体释放Cyt七。 13－MTD使线粒体跨膜电位降低发生很早，并不是因为继发于线粒体渗透性膜孔开放，而是 13－MTD亘接作用于线粒体的结果。而随后的Cytc外流可能主要是Bax表达上调及Bcl上表达下调的协同作用的结果，其次可能与 13－MTD直接促使线粒体释放 Cyt七。同时我们观察到 13－MTD还能使线粒体 DNA（mtDNA）发生双链断裂损伤。 以上的结果表明 13－MTD的促凋亡作用与线粒体通路有关。线粒体的细胞色素C外漏至细胞浆是关键步骤。Bax和BclZ在线粒体的上游起着调控的作用。并且 13－MTD能使 mtDNA双链断裂。可见线粒体功能改变是 13－MTD的重要作用。这些结果以及 13－MTD的衍生物构效关系探讨，表明这种新类型，毒性很小的化合物有望作为肿瘤防治的新类型药物。