木素是自然界中含量最丰富的可再生性有机资源之一，其生物降解构成自然界碳素循环的限速步骤。真菌中的白腐菌类具有完整的木素降解体系，能将木素彻底氧化性降解为CO<,2>和H<,2>O。黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)作为一模式菌株，得到深入研究。木素过氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)就是最早从此菌中发现的，并由此作为一个新的起点，推动了白腐菌酶学领域的深入发展。但由于木素结构复杂，至今其生物降解机制仍未阐明，各类木素降解酶在胞外都难以实现对天然木素的彻底降解；免疫标记研究证明，LiP和MnP等大分子酶蛋白并不能直接穿过完整木材的微孔结构，进入细胞壁以启动木素的降解。这些研究对已发现的木素降解酶在天然木素降解中的作用提出了疑问，并启发人们推测可能有多种低分子活性物质和木素降解酶协同参与木素生物降解，因而活性低分子物质在木素、纤维素降解中的作用成为一个新的研究热点。目前发现的参与木素降解的低分子物质除O<,2>和H<,2>O<,2>外，主要有羟基自由基／铁离子、活性氧基(reactive oxygen species，ROS)、藜芦醇(veratryl alcohol，VA)、草酸等小分子有机酸／锰离子、3-羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic acid，3-HAA)等，但迄今为止，关于它们在木素生物降解过程中的作用都是推测。 早在1996年，本实验室即发现木霉中的低分子肽类具有氧化性降解纤维素的能力，此后由褐腐真菌中分离纯化到具有类似功能的小肽Gt factor，本研究工作是上述工作的深入。本论文以P. chrysosprium胞外培养液中分子量5000 Da以下的低分子系统为研究对象，细致而全面地考察了P.chrysosprium胞外低分子系统的性质，通过一系列分离纯化步骤，从其中获得三种新型低分子量物质，分别命名为Pcfactor(Pc因子)、Pc reducer(Pc还原因子)和MnP promoter(MnP促进因子)。这三种低分子物质功能各具特色，Pc factor具有酚氧化活性，Pc reducer具有还原某些自由基的性质，MnP promoter则具有促进MnP活力的功能，采用紫外可见光谱(UV-Vis)、红外光谱(FT-IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)、电子自旋共振(ESR)等方法探索了其结构与性质，研究了它们在木素生物降解中的作用，并进一步做了组建胞外可连续降解木素的氧化还原体系的探索，取得了初步结果。本研究丰富了人们对白腐菌胞外低分子系统在组成、功能等方面的认识，并在检测方法和木素降解研究思路上做了积极的探索。 本论文的主要研究结果如下： 一、从P.chrysosprium胞外培养液中分离到三种新型低分子量组分，它们的结构、性质各具特色，根据来源或性质，分别命名为Pc factor、Pc reducer和MnP promoter 1、具有类似漆酶活性的低分子量组分Pc factor 从P.chrysosprium的培养液中分离到一个新的具有酚氧化活性的低分子量组分，命名为Pc factor(Pc因子)。Pc factor能够直接氧化酚型木素模型物，如2,6-二甲氧基酚(2,6-dimethoxyphenol，2,6-DMP)，2,2’-连氮二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(2，2’-azinobis(3-ethylbenzathiazoline-6-sulfinic acid)，ABTS)和丁香醛连氮等，不需要Mn<2+>和．H<,2>O<,2>的参与。Pc factor与2,6-DMP反应的动力学特点如图1所示： Time(sec) Fig.l Reaction process Of 2,6-DMP oxidized by Pc factor and fitting data by sigmoidal equation Pc factor与2,6-DMP反应的动力学符合S型曲线模式，反应速率上升很快，可迅速到达饱合值，适合用Sigmoidal does-response (variable slope)方程拟合。这与MnP和2,6-DMP的反应动力学特点明显不同(MnP的v-t曲线为线性，符合一级反应动力学模式)。这一动力学特点表明在没有新的电子供体和受体存在的条件下，Pc factor氧化能力不能持续进行，表现为一个电子传递体的特征。该物质对热稳定，在酸性条件下易失活，弱碱性条件下保持稳定，它具有螯合Fe<3+>的能力，并能够将Fe<3+>还原为Fe<2+>，但不能产生羟基自由基HO。其氧化作用需要金属离子和O<,2>的参与，为木素生物降解过程中的一类新的氧化机制，表明Pc factor在此氧化还原体系中可能执行电子传递体的功能。Pc factor的发现和作为木素氧化性降解过程中的一个电子传递体的深入研究，对解决木素生物降解这一难点可望产生一定的影响。 经HPLC凝胶过滤测定Pc factor的分子量大约在600 Da，左右，其氨基酸组成分析表明，Pc factor含有Glu，Gly和Val三种氨基酸，其紫外和红外光谱也显示Pc factor含有氨基酸，氨基酸的Ca信号在<13>C-NMR方法中也可检测到。但Pc factor的质谱分析未得到分子离子峰，其碎裂片断表明还存在其它未知结构。初步推断Pc factor应属于多肽类物质，其分子结构需要更深入的分析和测定。 2、具有还原自由基能力的低分子组分Pcreducer 木素生物降解过程不是单纯的氧化反应，其中必然涉及到还原反应，纤维二糖脱氢酶因其还原性能而备受关注。从P.chrysosprium胞外培养液中首次分离到具有还原自由基能力的低分子量组分，命名为Pc reducer(Pc还原因子)。该物质具有明显的还原特性，用硫代巴比妥酸(Thiobarburic acid，TBA)方法检测能够还原羟基自由基的能力，并采用电子自旋共振技术(ESR)进一步证实(图2)。在一定条件下，此物质也可以还原稳定的氮氧自由基如4-maleimideo-TEMPO。Pc reducer能够缓解过氧化物酶氧化酚类物质引起的聚合反应，并影响LiP和MnP的活力。该物质对热稳定，但在空气中可以被氧气缓慢氧化，且具有螯合Fe<3+>的能力，并能够将Fe<3+>还原为Fe<2+>。Pc reducer的还原特性可能为一类新的还原途径和机制，在木素生物降解的还原过程中起到重要作用。 MALDI-TOF和ESI／MS质谱结果显示Pc：reducer分子量为1017 Da，且具有分子量为ll3Da的结构单元，元素分析表明为一含氮化合物，但其氨基酸组成分析说明Pcreducer不含氨基酸。红外光谱的解析图谱可见明显的N．H信号、酰胺I带、酰胺II带和酰胺Ⅲ带，NMR谱结果显示可能含有的结构，推断Pcreducer属于聚酰胺类物质，其具体结构有待于进一步研究。 3、具有促进锰过氧化物酶活力的低分子组分MnPpromoter 经检测，在迄今已知的所有木素降解真菌的胞外酶液中都有MnP。由于已知某些 可降解天然木素的菌类不分泌LiP，黄孢原毛平革菌的LiP缺陷株也降解天然木素，因此，MnP在木素降解中的关键作用日益获得共识。 从P.chrysosprium发酵液中通过一系列纯化步骤得到具有促进MnP活力的低分子组分，命名为MnP promoter(MnP促进因子)。该物质对热比较稳定，能够促进MnP活力，其机理可能是通过螯合Mn<3+>，形成氧化还原电势较高的稳定的复合物。由于条件限制，目前尚未检测到它扩大MnP的底物范围，从而氧化非酚型结构；它具有螯合Fe<3+>的能力，并能够将Fe<3+>还原为：Fe<2+>。对其深入研究将对明确木素天然降解中MnP的定位和阐明木素的生物降解机制具有重要意义。<3+> 该组分分子量1389 Da，其质谱和核磁结果显示可能是由分子量为98 Da的结构单元组成，不含氨基酸残基，其紫外可见光谱分析可见在260 nl／1左右有较明显的特征吸收，可能由五元或六元环的大π共轭结构引起的，初步推断MnP promoter属于聚合杂环类物质，其分子结构尚待深入研究和测定。 二、根据Pcfactor和Pcreducer的性质提出体外组建可持续性木素降解的氧化体系的思路，并进行初步探索。 生物体系中涉及能量产生的氧化还原作用，都是由电子传递链来进行的，由NADH到分子氧经过多个电子传递体，逐步传递电子，应为一共同的规律。但是，目前尚未把这种认识应用在木素氧化性降解研究中。沿用常规的酶学研究方法，木素生物降解机理研究进展缓慢。我们提出根据Pc factor和Pc reducer的性质在胞外组建可持续性进行的木素氧化性降解系统，可望为木素降解研究开创一条新途径。 但自由基引发的木素氧化性降解具有随机性，产物种类繁杂，目前还难以依据呼吸链中类似的研究方法，我们提出试用本实验室在同类研究中应用过的电化学方法、电子自旋波谱法、色质联用等方法，以Pc factor的氧化性质和Pc reducer的还原性质为根据，来研究胞外组建系统的电子传递途径。