半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、还原型谷胱甘肽(GSH)是人体细胞内非常重要的三种小分子生物硫醇(Biothiols),在生命体的各项生理活动中起着重要作用。Cys是多种蛋白的重要组成部分,参与基因翻译后修饰、生物催化等重要生理过程；当其在细胞中含量异常时,会引起人体生长缓慢、神经性中毒、肝损伤等疾病。Hcy虽然在血清和细胞中是三种生物硫醇里含量最少的,但其作用不容忽视,是多种遗传病的重要标志,例如高胱氨酸尿症、心血管畸形等。GSH参与基因调节,与其氧化态维持着细胞内的氧化还原平衡；当其含量异常便会导致各种恶性肿瘤、器官衰竭。有机小分子荧光探针是检测生物样本中生物硫醇的重要方法,简单、灵敏,且不损伤生物样本,有助于疾病的临床诊断和生理过程研究。由于三种生物硫醇的结构、性质相似,目前需要克服的难点依然是如何有效识别一种生物硫醇,或者同时区分三种生物硫醇。二氧化硫(SO2)衍生物被广泛用作食品防腐剂、抗氧化剂,工业漂白剂、还原剂等,被人体吸入会引发肺水肿,摄入过量则导致腹泻、荨麻疹等疾病。小分子肼(N2H4)同样是工业生产和人类生活中必不可少的化学药品,被人体过量摄入后会导致神经中枢损伤等,己被认为是可疑致癌物。利用传统方法检测SO2衍生物和肼,成本高且损伤生物样本,利用有机小分子荧光探针检测的方法被相继报道,但是在实际样品和生物样本中的应用相对较少。荧光光谱法与其他方法相比较,具有选择性好、灵敏度高、待测样品制备方便、仪器操作简单、实时响应、空间分辨率高、生物成像等优势。随着荧光成像技术的发展,近几年小分子荧光探针已成为监控活细胞中生理过程的重要手段。香豆素类衍生物具有荧光量子产率高、Stokes位移大等优点,通过对母环的修饰可以得到各种发射波段的荧光,被广泛用作小分子探针的荧光团。本论文基于香豆素类荧光团,结合被检测物性质,设计合成了八种反应型小分子荧光探针,与被检测物发生不可逆的化学反应,通过反应前后荧光信号的变化,达到定量检测的效果。具体包括以下内容：第一章,简要综述荧光探针的识别机理,以及香豆素类荧光团的反应型荧光探针的研究进展。第二章,合成了六种基于香豆素的小分子生物硫醇荧光探针ACCA、 ACA、DPCA、PPN、DPCS、PBQC,不仅都可以在水溶液中裸眼识别不同的生物硫醇,同样成功应用于小牛血清和活细胞成像。探针ACCA利用两个相邻的反应位点,首先与一分子Cys/Hcy的巯基发生亲核取代反应,邻位或间位氨基迅速发生分子内重排,得到氨基取代产物,同时与另一分子Cys/Hcy发生缩合-环化作用,得到最终产物；与GSH的巯基发生亲核取代反应,继而进行分子内缩合得到十二元环的亚胺正离子化合物,做到细胞内、外均能比率区分GSH、Cys/Hcy,且互不干扰。探针ACA、DPCA利用丙烯酸酯为识别基团,与Cys发生Michael加成-环化反应,释放出前体荧光团,分别得到单一识别Cys的荧光增强信号和荧光比率增强信号。探针PPN同样以丙烯酸酯为识别基团,与GSH发生Michael加成反应,得到荧光增强信号,在双光子激发条件下也可以定量检测GSH。探针DPCS连接硝基磺酸酯为识别基团,与小分子生物硫醇发生裂解反应,得到两个发射峰同时增强的比率型荧光信号,并且在双光子激发条件下也可以定量检测生物硫醇。探针PBQC以醌为识别基团,与GSH发生Michael加成反应,阻断探针分子的PET过程和分子内旋转作用,得到荧光增强信号。第三章,合成具有红色荧光的探针BICO,其结构中的α,β-不饱和酮作为识别基团,与SO2衍生物发生Michael加成反应,不仅用于活细胞比率荧光成像,还可以在自来水、白糖、白葡萄酒中定量检测S02衍生物,制作成试纸条也能够裸眼识别亚硫酸氢钠溶液的浓度。同时作为第一个亚硫酸氢根双光子荧光探针,具有优秀的双光子荧光成像潜力。第四章,合成含有两个苯并吡喃结构的近红外荧光探针BPCC,利用螺环机理响应小分子肼。探针不仅可以在PBS缓冲溶液中特异性响应液态肼,也可以应用于小牛血清和HeLa细胞中肼的检测,进一步将探针附着在硅胶板上可直接检测气态肼,裸眼即可观察到颜色变化。本论文主要创新点：1.合成了八种香豆素类水溶性荧光探针,全部通过与被检测物发生不可逆的化学反应改变探针荧光性质,裸眼即可观察到识别效果,并且成功应用于小牛血清或活细胞成像；2.根据三种小分子生物硫醇结构的细微差异,通过不同的识别机理,改变探针荧光团性质,得到区别检测的效果。包括多种反应类型：探针与一分子GSH的取代-环化作用,与两分子Cys/Hcy的取代-重排-缩合-环化作用；a,p-不饱和羰基作为识别基团,与GSH的巯基发生Michael加成反应,与Cys的巯基和邻位氨基发生Michael加成-环化反应。3.以香豆素为荧光母体,连接吡唑啉、苯并咪唑、苯并吡喃等杂环得到了橘红色荧光化合物H-DPC、红色荧光探针BICO、近红外荧光探针BPCC。化合物H-DPC具有两个发射波长,可以结合各种荧光淬灭基团和识别基团得到比率型荧光探针；基于BICO、BPCC响应前后明显的颜色变化,可以进一步做成试纸直接用于检测液态或气态的被检测物。