羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。以体温升高,皮肤出现红色斑块、丘疹脓疱、最后结痂,形成大小不一的结节为主要特征。该病世界范围内分布,呈暴发或散发流行,给养羊业带来严重的经济损失。近年来有感染宿主范围扩大,传播风险增加的趋势。为了进一步了解羊痘病毒可能的宿主范围ANK基因,确定其生物学功能,本研究表达并纯化了羊痘病毒ANK140基因的全长和截短的蛋白,并筛选了其与宿主细胞之间互作的蛋白,制备了其多克隆抗体,为进一步研究ANK140基因的生物学特性及功能奠定基础;也为羊痘的检测、诊断试剂和新型疫苗的研究提供新方向。1.绵羊痘病毒ANK140基因的克隆及同源性分析根据绵羊痘病毒参考株（登录号NC₀04003.1）ANK140基因序列,分别设计了其全长与GST标签和His标签融合表达以及与His标签融合表达的3个高抗原区域分段引物,通过PCR扩增,连接、转化、菌液PCR、双酶切和测序鉴定构建了5个原核表达载体,并对ANK140基因进行生物信息分析和遗传进化树分析。结果成功扩增了5条核苷酸序列,构建了p GEX-6p-1-ANK140和p ET-42b-ANK140两个全长表达的载体及p ET-42b-ANK140-1、p ET-42b-ANK140-2和p ET-42b-ANK140-3三个分段表达的载体;测序结果显示ANK140基因全长1500 bp,各分段分别为345 bp、378 bp、420 bp,与理论大小相符。遗传进化树分析显示ANK140基因分成三个分支,分别是山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛疙瘩皮肤病病毒。扩增的基因序列与印度的斋浦尔绵的羊痘病毒具有最近的亲缘关系。2.ANK140蛋白的原核表达纯化及互作蛋白的筛选将构建好的5种重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中。37℃,0.1M的IPTG进行诱导表达,用SDS-Page检测蛋白的表达情况,并用Western Blot鉴定其免疫原性。对GST融合表达的蛋白用谷胱甘肽琼脂进行纯化,His标签蛋白用镍亲和层析法进行纯化;将纯化的蛋白95 ug与镍琼脂糖和羊睾丸细胞裂解液充分混悬过夜,3次离心清洗后沉淀做SDS-Page,观察新增条带,切取新增条带进行MS测序。结果表明,两个全长载体均未较好表达。带His标签的ANK140-1、A NK140-2和ANK140-3蛋白,这3个分段蛋白得到了表达,其大小分别为12 k Da、14 k Da、14 k D a,并得到纯化蛋白ANK140-1和ANK140-3。带His标签的ANK140-3蛋白通过pull down方法筛选到了1个互作蛋白,切取新增互作蛋白条带送公司进行MS测序,结果未测得序列。3.多克隆抗体的制备将纯化后的带His标签的ANK140-1蛋白作为免疫原,与免疫佐剂等量混合,注射抗原蛋白0.25mg/kg,皮下共分6～8点注射,对实验组新西兰大白兔定期进行3～4次免疫,获得兔抗His-ANK140多克隆抗体。最终通过ELISA检测,结果显示三免效价正常,血清效价已达到1:64;采集的三免的血清做Western Blot鉴定,实验结果显示,在10～15 k Da之间有目的条带产生,证明血清中有多克隆抗体产生,且能够特异性识别原核表达的ANK140蛋白。