论文部分内容阅读
第一部分载舍曲林和吲哚箐绿的脂质体的制备、基本性质及细胞毒性检测目的制备一种共载盐酸舍曲林(sertraline hydrochloride)及吲哚箐绿(indocycline green,ICG)的多功能脂质体(lipsome loaded sertraline hydrochloride and indocycline green,Ser/ICG@Lip),检测其基本理化性质,并观察该脂质体的细胞毒性。方法1.纳米粒的制备及基本性质:采用薄膜分散-水化-超声法制备包载盐酸舍曲林和吲哚箐绿的新型纳米粒(lipsome loaded sertraline hydrochloride and indocycline green,Ser/ICG@Lip),用同样的方式制备仅载盐酸舍曲林和仅载吲哚箐绿的脂质体(lipsome loaded sertraline hydrochloride,and lipsome loaded indocycline green,Ser@Lip,ICG@Lip)。在光学显微镜Ser/ICG@Lip纳米粒的形态,在透射电镜下观察其纳米形态及结构;用马尔文粒径仪器检测粒径、电位;采用紫外分光光度法检测纳米粒中盐酸舍曲林盒吲哚箐绿的含量,分别计算各自化合物的包封率和载药量;将Ser/ICG@Lip分散液置于磷酸盐缓冲液(PBS)中一周,分别于0,1,3,7d检测其粒径,观察它的稳定性。此外,使用3500D透析袋,在不同PH透析液中(PH5.5和7.4)检测Ser/ICG@Lip中舍曲林的累计释放率(3h,6h,9h,12h,24h,36h)2.纳米粒的细胞毒性:采用细胞计数Kit-8法(CCK-8)检测Ser/ICG@Lip脂质体在体外的细胞毒性。分别将不同浓度的Ser/ICG@Lip,Ser@Lip,ICG@Lip,游离盐酸舍曲林和游离吲哚箐绿按照对应浓度加入转移性肾透明细胞癌细胞(Caki-1)孵育好的96孔板中,共同孵育24小时,用无血清培养基组作为对照组。用CCK-8法检测各孔细胞活力。每组重复五次。结果1.纳米粒的基本性质:用薄膜分散-水化-超声法成功制备包载盐酸舍曲林和吲哚箐绿的新型纳米粒,Ser/ICG@Lip。该纳米粒在光学显微镜下分散较好,大小均一,呈圆形点状。透射电镜观察呈圆球形,形态规则。用马尔文粒径仪检测Ser/ICG@Lip,Ser@Lip,ICG@Lip的粒径,分别为237.33±18.61nm,180.07±10.00nm,和240.17±96.32nm。zeta电位分别为-25.93±1.20mV,-36.47±4.74mV和-59.07±4.40mV。Ser/ICG@Lip纳米粒中ICG的包封率为分别为98.00%,载药量为0.490mg/ml,盐酸舍曲林的包封率为50.45%,载药量为184.00μmol/l。Ser/ICG@Lip在PBS中一周内的粒径基本没有变化。而在恒温37℃环境下,微酸环境促进Ser/ICG@Lip中舍曲林的释放,呈初期爆发性释放,后期缓慢释放。2.纳米粒的细胞毒性:用CCK-8法检测细胞活性,Ser/ICG@Lip纳米粒具有良好的细胞安全性,并且降低了游离舍曲林的细胞毒性。结论1.本研究成功合成了共载盐酸舍曲林及ICG的脂质体(Ser/ICG@Lip),并检测了其基本性质。2.Ser/ICG@Lip纳米粒具有良好的细胞安全性,这为诊疗类生物制剂的应用打下坚实的基础,在达到杀伤肿瘤细胞效果的同时可以有效降低游离舍曲林的不良反应。第二部分载舍曲林和吲哚箐绿的脂质体的光热效果及双模态成像能力目的研究共载舍曲林和吲哚箐绿的脂质体的光热效果,以及其近红外荧光成像和光声成像能力。方法1.体外光热效果:在808nm激光仪不同激发密度下辐照不同浓度的Ser/ICG@Lip脂质体来评估其光热性质。PBS,Ser@Lip,ICG@Lip和游离ICG溶液作为对照组,用红外热像仪记录五分钟的温度变化,分别在0s,10s,20s,30s,60s,90,120s,180s,240s,300s记录红外热像。2.体外近红外荧光成像和光声成像:用Xenogen IVIS Spectrum成像系统(Perkin Elmer USA)对Ser/ICG@Lip进行体外近红外荧光成像,及信号强度分析。将不同浓度Ser/ICG@Lip分散液置于96孔板,对应ICG浓度为0.490-0.030mg/ml。每个浓度重复三次。此外,使用Vevo LAZR超声成像系统(Toronto,Canada)评估Ser/ICG@Lip的光声成像能力,采集对应光声图像及光声信号强度。1.250mg/ml的Ser/ICG@Lip分散液在680-970nm波长下取得最佳成像波长。在最佳成像波长下,取得不同浓度Ser/ICG@Lip悬浮液(1.250-0.039mg/ml)的光声图像及光声信号值。结果1.体外光热效果:1.25mg/ml的Ser/ICG@Lip在808nm,2w/cm~2激发强度下取得最高温度,可达80℃。游离ICG和ICG@Lip均有明显的光热效应,且包裹ICG的两种脂质体的光热转换效率较游离ICG高,而PBS和Ser@Lip在相同的条件下并没有明显的温度改变。2.体外近红外荧光成像和光声成像:Ser/ICG@Lip在近红外荧光成像中表现出荧光信号随着浓度增高而降低的趋势,但不是线性关系。相应的,Ser/ICG@Lip在825nm处有最大吸光度和最佳光声图像,因此825nm被作为最佳光声成像激发波长。在最佳激发波长下,Ser/ICG@Lip的光声信号呈浓度依赖性增强。结论Ser/ICG@Lip脂质体具有良好的光热效果,并且可用于近红外荧光及光声成像。第三部分载舍曲林和吲哚箐绿的脂质体的靶向性及对转移性肾透明细胞癌细胞的化学-光热联合杀伤作用目的观察Ser/ICG@Lip脂质体的体外靶向性,并评估该纳米粒对转移性肾透明细胞癌细胞的化学-光热联合杀伤作用。方法1.体外细胞摄取:用CLSM观察在不同时间点(0.5,1,2,3,4h)转移性肾透明细胞癌细胞(Caki-1)对Ser/ICG@Lip的摄取。并对目标区域(ROI)荧光信号强度量化分析。2.体外化学-光热联合治疗2.1用CCK-8法评估纳米粒对靶细胞的杀伤作用:Caki-1细胞种植在96孔板中,分别用不同浓度的Ser/ICG@Lip与之共孵育4小时,再分别用不同激发密度的808nm激光处理各组细胞,再共孵育12小时后,用CCK-8法计算各组细胞活性。无血清培养基组作为对照组,每组重复3次。为了分别比较光热治疗,化疗和光热联合化疗的治疗效果,预设7组:无血清培养基治疗组,仅激光治疗组,仅Ser/ICG@Lip治疗组,Ser/ICG@Lip+激光治疗组,仅ICG@Lip治疗组,ICG@Lip+激光治疗组,游离舍曲林治疗组。上述各组给予各自处理后孵育4小时,用808nm,2w/cm~2激光处理其中三组(激光治疗组,Ser/ICG@Lip+激光治疗组和ICG@Lip+激光治疗组)。再孵育12小时后,用CCK-8法计算各组细胞活性。每组重复3次。2.2用CLSM观察纳米粒对靶细胞的杀伤作用:Caki-1细胞种植在激光共聚焦细胞培养皿中,分组及各自处理方式如前述。最后孵育12小时后,用Calcein-M和PI对细胞进行共染色,CLSM观察采集荧光图像。结果1.体外靶向性:Caki-1细胞对Ser/ICG@Lip的摄取呈时间依赖性,在0.5h时观察到细胞对脂质体有少量的摄取,在4h时达到顶峰,4h与3h的荧光强度比较没有统计学差异,但仍是后者的1.2倍。2.体外化学-光热联合治疗:Ser/ICG@Lip中ICG浓度为0.49mg/ml时,随着激光能量密度的增加细胞存活率始终保持在极低水平,而在808nm,2w/cm~2辐照下,细胞存活率随着Ser/ICG@Lip中ICG浓度升高而显著降低。在验证光热联合化疗的治疗效果的实验中,我们发现当Ser/ICG@Lip 1.25mg/ml时,Ser/ICG@Lip+激光组治疗组(作为光热-化疗联合治疗组)、ICG@Lip+激光治疗组(作为光热治疗组)和游离舍曲林治疗组(作为化疗组)三组中细胞存活率显著降低。当Ser/ICG@Lip低于0.625mg/ml时,光热化疗联合治疗组细胞存活率显著低于单一光热和化疗治疗组,而单一光热和化疗治疗组之间差异不显著。仅激光治疗组、无激光辐照的Ser/ICG@Lip和ICG@Lip治疗组对肿瘤细胞几乎没有杀伤力。CLSM观察到类似的结果。结论Caki-1细胞可快速有效摄取Ser/ICG@Lip,并且脂质体在808nm激光辐照下可以对细胞产生化学-光热联合杀伤作用。