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肝癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤。2012年调查显示,肝癌每年新发病例位于全球新增癌症病例第6位,而死亡病例位居全球癌症死亡病例的第2位。中国是肝癌的高发国家,每年新增肝癌病例及死亡病例均约占全球的50%。由于对于肝癌发病机制的认识不足以及缺乏有效的靶标,肝癌的分子靶向治疗研究进展极为缓慢。因此,鉴定促进肝癌发生发展的关键信号通路、进而开发相应分子靶向药物已经迫在眉睫。Neddylation是一种新型蛋白翻译后修饰方式,它通过将类泛素分子NEDD8在酶促催化作用下与底物蛋白共价结合,影响底物蛋白的构象、降解和定位等功能,从而调控一系列的生命活动过程,如细胞周期、增殖和凋亡等。研究表明,neddylation通路可促进肿瘤发生发展,而针对其进行靶向干预可显著抑制肿瘤生长。近年来,neddylation通路小分子抑制剂MLN4924作为具有良好应用前景的新型分子靶向药物被成功开发。鉴于其高效低毒的特点,MLN4924已经进入多种肿瘤的I/II期临床试验评价阶段。研究表明,MLN4924发挥抗肿瘤作用的主要机制是灭活底物cullin蛋白的neddylation修饰,从而灭活Cullin-Ring泛素连接酶(CRL)功能,导致CRL底物累积,最终抑制肿瘤细胞增值和细胞死亡。我们前期研究发现,MLN4924可通过诱导肝癌细胞发生凋亡而发挥显著抗肿瘤效果。最近,我们发现MLN4924还可以引起CRL底物Deptor的积累,从而灭活mTOR通路诱导细胞发生促生存的保护性自噬,提示阻断细胞自噬应答可以增强MLN4924的抗肝癌效果。本项目旨在检验阻断自噬应答增强MLN4924体内外抗肝癌效果的假说,进而阐明其作用机制,为临床应用MLN4924和自噬阻断剂进行肝癌联合治疗提供科学依据。本项目主要发现如下：1)利用药理学或遗传学方法阻断细胞自噬应答,显著增强MLN4924对肝癌细胞增殖抑制作用和凋亡的活化。2)阻断自噬增强MLN4924诱导的肝癌细胞凋亡主要通过活化NOXA。自噬阻断剂氯喹联合MLN4924引起NOXA的显著转录活化和蛋白表达上调,而下调NOXA的表达可显著减弱氯喹联合MLN4924引起的细胞凋亡和增殖抑制。3)在机制上,NOXA的表达上调一方面依赖于氯喹联合MLN4924引起CRL底物CDT1和ORC1的累积；CDT1和ORC1的积聚诱导DNA损伤,进而上调NOXA的表达。RNA干扰CDT1和ORC1的表达可部分缓解NOXA依赖的细胞凋亡及增殖抑制。另一方面,氯喹联合MLN4924可诱导肝癌细胞产生高水平活性氧自由基,促进NOXA的转录激活和蛋白表达上调。利用ROS清除剂NAC可显著降低NOXA转录表达水平,减弱氯喹联合MLN4924诱导的细胞凋亡和增殖抑制。4)通过构建小鼠肝原位移植瘤肿瘤模型,在体内验证了自噬阻断剂氯喹增强MLN4924抗肝癌效果。利用免疫组化技术,我们发现氯喹联合MLN4924可显著上调小鼠肝癌组织中NOXA表达和Caspase 3活化,提示氯喹联合MLN4924在体内可显著诱导肝癌细胞凋亡。综上所述,本项目验证了阻断自噬通路对MLN4924体内外抗肝癌治疗的增效作用,深入阐明了阻断自噬后肝癌细胞活化细胞凋亡的分子机制,为进一步在临床探索通过阻断自噬通路增强靶向neddylation通路抗肝癌治疗的新策略提供了坚实的科学依据。