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多酶复合体系因其高效的整体催化能力已成为合成生物学的研究热点,构建高效稳定的人工多酶反应器在生物催化领域具有广阔的应用前景。在已有的报道中,研究者模拟和借鉴天然催化体系多酶组装的策略,建立了多种组装方法,包括蛋白融合技术、骨架介导的自组装技术和固定化技术等,且应用这些策略在细菌体内外成功构建了高效稳定的人工多酶复合物,提高了级联反应催化效率。然而上述组装模块存在许多问题,如多酶复合物不稳定,易受环境因素影响;只能在特定末端进行组装;只适用于体外系统等。因此探索和挖掘新型组装模块,构建更加稳定且适用范围更广的多酶催化组装体系仍具有重要实际意义。SpyCatcher和SpyTag互作蛋白可在各种条件下通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体,在蛋白质领域获得了广泛应用。为了探索SpyTag/SpyCatcher在大肠杆菌体内外多酶复合体系形成有序自组装分子的能力,本研究将SpyCatcher和SpyTag分别与细胞色素单加氧酶突变体P450BM3m（A74G/F87V/L188Q）和葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase,GDH）进行融合表达,以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的SpyTag/SpyCatcher双酶自组装复合体。本课题主要包括体外实验和体内实验两部分。体外实验部分,首先对融合蛋白SpyTag-GDH、SpyCatcher-P450BM3m和原始酶GDH、P450BM3m进行表达纯化,酶活测定结果显示,蛋白融合不影响原始蛋白的催化活力。然后通过混合融合蛋白SpyTag-GDH和SpyCatcher-P450BM3m获得双酶复合物,并利用SDS-PAGE蛋白电泳和动态光散射实验证实体外成功实现了多酶复合物的自组装。对自组装双酶复合物和游离双酶系统的催化活力和温度稳定性进行分析,结果显示自组装多酶复合物能有效提高级联反应初速率,当NADP+浓度为20μmol/L时,自组装多酶复合体系的催化速率是游离双酶系统的1.7倍;且自组装多酶复合物具有更优良的温度稳定性,孵育时间越长温度越高,自组装复合物稳定性优势愈加明显。体内实验部分,首先构建重组质粒pACYCDuet1-GDH和pACYCDuet1-SpyTag-GDH,将pACYCDuet1-SpyTag-GDH和pET28a-SpyCatcher-P450BM3m同时转入E.coli BL21（DE3）,构建共表达SpyTag-GDH和SpyCatcher-P450BM3m的重组工程菌。SDS-PAGE蛋白电泳、Western Blotting及质谱结果证实SpyCatcher-P450BM3m与SpyTag-GDH在大肠杆菌胞内成功形成了自组装多酶复合体。对不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力进行系统分析,结果表明,当自组装多酶复合物细胞培养至OD600为0.6-0.8时加入0.5mmol/L IPTG在16℃继续培养18 h,工程菌对吲哚（2 mmol/L）与葡萄糖（4 mmol/L）的全细胞催化能力最强,靛蓝产量最高达258 mg/L,是未组装游离多酶系统的1.9倍,比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍;反应70 min后达到反应平衡,转化率为52%,证实了含有自组装辅酶再生系统的细菌具有更优生物合成效率。本研究成功实现了SpyTag/SpyCatcher介导的多酶体系在大肠杆菌体内和体外的自组装和高效转化体系,为体外多酶复合物组装体的设计和利用细胞工厂高效生产相关目标化学品提供了新思路。