论文部分内容阅读
目的:观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法:应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原CD29、CD44及CD45鉴定。程序降温盒冻存BMSCs,3个月后复苏细胞显微镜下观察其增殖能力,台盼蓝染色检测其存活率。经成脂(1O%FBS+H-DMEM、4×10-5 g/L地塞米松、10mg/L IBMX、10mg/L胰岛素)、成骨( 10%FBS+H-DMEM、4×10-6g/L地塞米松、0.5g/L Vitamin-c、1g/Lβ-磷酸甘油钠)以及成神经（DMEM/F12、10ng/mL b-FGF、10ng/mL EGF、10ng/mL PDGF、100μg/mL转铁蛋白、0.03μM亚硒酸钠）诱导液体外诱导BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞分化。分别对诱导两周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Vankossa银染染色及碱性磷酸酶染色。对成骨诱导3d、5d、7d、9d、12d、15d、18d、21d的细胞进行兔子Ⅰ型原胶原（procolⅠ）酶联免疫分析。用免疫细胞化学方法检测诱导成神经元样细胞的特异性表面标志。结果:全骨髓贴壁法可获得BMSCs,经流式细胞术检测兔BMSCs表面抗原,CD44表达率为87.92%,CD29表达率为95.36%,CD45表达率为2.51%,第三代BMSCs生物特征基本一致。冻存复苏后的细胞存活率为85%,传代后细胞恢复原来的增殖能力。在一定条件下能诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞及神经元样细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。成骨诱导3d至21d,procolⅠ呈增多趋势。成神经诱导两周后细胞形态开始发生变化,对照组BMSCs经免疫组化染色弱表达神经特异性烯醇化酶（NSE）;因子组细胞强表达神经特异性烯醇化酶（NSE）,弱表达巢蛋白（nstin）。结论:全骨髓贴壁法是分离培养兔BMSCs简便可行的方法。骨髓间充质干细胞来源丰富、易于体外分离培养并大量扩增、具有多向分化潜能,是组织工程的优良种子细胞。