转HhERF基因百脉根的遗传转化及抗病、耐盐与抗旱性分析

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世界农牧业长期受到干旱、高盐、植物病害等逆境的影响,造成农牧作物减产。针对这一问题,各国纷纷采取了相关措施,如在生物学领域,从开展抗逆农牧作物新品种的选育,到抗逆功能基因的克隆,再到目前转录因子的研究,旨在获得抗逆农作物新品种,以适应当前恶化的环境。本实验室已从沙生植物铃铛刺(Halimodendronhalodendron(Pall.)Voss.)中克隆出抗逆转录因子基因HhERF并构建表达载体,本研究将HhERF基因转入豆科全价饲料牧草百脉根(LotuscorniculatusL.)中并进行抗逆功能分析。主要研究结果如下:1、通过PCR、酶切及测序验证载体PMI-HhERF的正确性。优化根癌农杆菌转化法及百脉根遗传转化体系,筛选获得抗性百脉根植株96株。提取百脉根植株的全基因组,经PCR检测获得转HhERF基因阳性苗23株,转化率达到24%。PCR-Southern检测进一步验证阳性苗的正确性。RT-PCR结果证明HhERF基因在RNA水平表达。Southern检测结果表明HhERF已经成功整合到百脉根基因组中,转录表达并且HhERF基因的拷贝数为单拷贝。2、建立百脉根扦插扩繁体系,采用L8(27)正交试验对百脉根扦插轻型基质筛选,确定配方木屑:椰糠:蛭石:育苗基质的比例为2:1:0:0或2:2:0:0的基质扦插育苗可获得较好的苗木。3、对转HhERF基因百脉根植株进行耐旱功能分析。以野生型和转基因百脉根为材料,对干旱胁迫0d、3d、6d、9d、12d及复水处理3d、6d后的百脉根进行生理生化指标的检测。试验结果表明:(1)在干旱胁迫下,转HhERF基因百脉根叶片含水量(RWC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化物酶(POD)活性峰值均高于野生型,丙二醛含量(MDA)低于野生型,叶绿素含量(Chl)两者无明显差异。证明转HhERF基因百脉根相比于野生型对干旱胁迫有较强的耐受性。(2)经过两次复水后,RWC、Chl、MDA、SOD、POD等指标均有一定程度的恢复,说明细胞膜所受损害在复水后均得到一定程度的修复。4、对转HhERF基因百脉根植株进行耐盐功能分析。本试验对在0、50、100、150、200、250mMNaCl胁迫下野生型和转基因百脉根进行了形态学及生理指标测量,试验结果表明:(1)从形态学指标来看,转HhERF百脉根植株生长受盐胁迫影响不明显。(2)从生理指标来看,盐浓度高于150mM时,转基因百脉根叶片含水量、叶绿素含量明显高于野生型,丙二醛含量低于野生型。证明转HhERF基因百脉根相比于野生型对盐胁迫有较强的耐受性。5、对转HhERF基因百脉根植株进行抗病功能分析。对转基因植株及野生型接种尖孢镰刀菌2d、4d、6d、8d、10d后统计发病率、病情指数及其他生理生化指标,试验结果表明:(1)转基因植株同野生型均于第6d发病,且发病率、病情指数均高于野生型。(2)超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化物酶(POD)活性峰值均高于野生型,丙二醛含量(MDA)低于野生型;叶片含水量(RWC)、可溶性糖含量变化两者差异不大。证明转HhERF基因百脉根相比于野生型对病害逆境有较强的耐受性。
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