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背景:肺癌的发病率与死亡率在全世界范围内增速迅猛。在我国,肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LAC)的发病率已超过鳞癌(Lung squamous cell carcinoma,LSCC)并不断上升,积极筛选LAC特异性的新型分子靶标是当前肺癌领域关注的热点。环状RNAs(circRNAs)由于其独特的结构、稳定性高、耐RNA酶等特性逐渐成为研究热点,circRNAs目前研究已经发现可在肿瘤的发生发展过程中扮演中重要的角色。但其在肺腺癌中的研究尚处于起步阶段。技术路线及方法:第一部分:LAC差异circRNAs筛选、验证及临床相关性研究首先,随机挑选5例女性LAC患者配对癌和正常组织行circRNAs/mRNA共表达芯片,挑选差异显著、均一性较好的5个circRNAs,在20例LAC患者标本中进行实时定量PCR(qPCR)验证,最终鉴定筛选出一个在LAC组织中显著上调的环状RNA——circPRKCI;随后,设计双向引物行RT-PCR进一步验证circPRKCI的存在,并结合核质分离及荧光原位杂交(FISH)实验探索circPRKCI亚细胞分布等生物学特性。最后扩大样本,在48对LAC新鲜组织样本及细胞株行qPCR,在92对LAC组织芯片(TMA)中行化学显色原位杂交(CISH)实验中验证circPRKCI的临床表达特征及其与预后的相关性。第二部分:circPRKCI在肺腺癌中的生物学功能研究体外功能研究:选择合适的肺腺癌细胞株A549及SPC-A1,通过沉默及过表达circPRKCI,进行CCK-8增殖实验、克隆形成实验、迁移侵袭实验、凋亡实验及细胞周期分析,全面评价circPRKCI是否可在体外影响肺腺癌的恶性行为。体内功能研究:分别构建BALB/c裸鼠LAC细胞株皮下荷瘤模型,免疫缺陷(SCID)小鼠患者来源肿瘤异体移植(PDTX)模型,通过瘤内注射特异性沉默circPRKCI的shRNA,体内评价circPRKCI是否可在影响肺腺癌的恶性进展。第三部分:circPRKCI促进肺腺癌恶性进展的分子机制研究首先,提取LAC组织gDNA,针对宿主基因PRKCI设计探针,探索其拷贝数与circPRKCI表达的关系;随后,采用过表达/沉默策略,设计拯救实验,结合 RNA 免疫共沉淀(RIP)、生物素标记的 RNA pull down(biotin-pull down)、双荧光素酶报告基因等技术探索circPRKCI发挥生物学功能的下游分子机制;最后在临床样本及荷瘤动物样本中验证circPRKCI与调控机制关键节点蛋白的相关性。主要结果:① circPRKCI的生物学特征:通过设计特异性反向引物行qRT-PCR证实可在LAC组织中验证到circPRKCI存在,circPRKCI耐RNA酶相比线性mRNA更加稳定,主要定位于细胞质中。② circPRKCI是潜在的LAC“促癌基因”:通过qRT-PCR和TMA原位杂交技术(CISH)发现在LAC患者中,近80%患者LAC癌组织circPRKCI显著高表达(P<0.001),有淋巴结转移组表达显著高于无淋巴结转移组(P<0.001),TNM分期越高、表达越高(P<0.001);Kaplan-Meier生存分析结果显示circPRKCI表达越高患者预后更差(P<0.05)。③circPRKCI可在体内、体外促进LAC恶性进展:我们设计了特异性干扰circPRKCI的小干扰RNA(siRNA)并构建了过表达circPRKCI的质粒,体外细胞功能学实验结果表明干扰circPRKCI可以显著抑制LAC细胞的增殖、迁移和侵袭能力并导致细胞周期阻滞于G1;而过表达circPRKCI的结果则相反。通过构建裸鼠皮下荷瘤模型和PDTX模型,我们发现敲减circPRKCI之后肺腺癌肿瘤的生长速度显著受到抑制。④宿主基因PRKCI扩增可导致circPRKCI表达上调:LAC细胞及组织qPCR实验均证实,宿主基因PRKCI拷贝数越高,circPRKCI表达越高,呈高度正相关(R2=0.453,P<0.01)⑤ circPRKCI通过内源竞争性RNA(ceRNA)机制调控转录因子E2F7:生物信息学分析circPRKCI可能结合的microRNA(共5个),Ago2-RIP实验显示circPRKCI可结合Ago2蛋白作为其发挥ceRNA机制的分子基础;biotin-pull down 实验证实 miR-545 及 miR-589 可与 circPRKCI 结合,但两者互相不影响各自表达水平;生物信息学及mRNA芯片共同筛选下游靶基因8个,其中E2F7在敲减circPRKCI后下调最明显。biotin-pulldown实验及双荧光素酶报告基因证实miR-545及miR-589均可靶向E2F7 mRNA的3’UTR区,且在mNRA及蛋白层面均可下调E2F7的表达;拯救实验证实miR-545及miR-589可大部分拯救circPRKCI促进LAC细胞株恶性进展的生物学功能。⑥临床及动物模型验证circPRKCI与E2F7表达显著正相关:48对LAC新鲜组织qPCR数据显示circPRKCI与E2F7表达显著正相关(R2=0.4935,P<0.01);裸鼠皮下荷瘤模型中移植瘤免疫组化显示沉默circPRKCI后E2F7及其已知下游基因p21、cyclinD1表达显著下调。结论:本研究系统的研究了 LAC中环状RNA的表达谱,并鉴定出新型环状RNA circPRKCI是一个在LAC癌组织显著高表达、可促进LAC增殖、侵袭转移等恶性进展行为的潜在“促癌基因”;体内外实验阐明了宿主基因PRKCI拷贝数扩增促进 circPRKCI 上调、circPRKCI 通过 ceRNA 机制吸附 miR-545 及 miR-589 表观上调转录因子E2F7表达的上下游分子机制;本研究从circRNAs角度揭示了促进LAC恶性进展的分子机制,可作为LAC诊断、治疗及预后评估提供潜在新靶标。