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灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.exFr.)Karst.)被历代医药家视为“扶正固本、滋补强壮”的珍品,其免疫调节作用是“扶正固本”的重要体现。灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides,GLP)是灵芝重要的活性成分之一,灵芝的免疫调节作用主要是多糖在起作用。由于灵芝多糖的分子量较大,人体缺乏相关的消化酶,很难直接被消化吸收,因此,胃肠道可能是灵芝多糖发挥其功效的主要场所。虽然现有研究中关于灵芝多糖的在体和离体实验可以说明灵芝多糖对肿瘤细胞、免疫细胞、细胞因子的分泌以及对系统免疫的影响等,但灵芝多糖难以被吸收而直接作用于相关细胞,所以其详细的作用机制仍然难以解释清楚。胃肠道不仅是机体重要的消化器官,也是机体重要的免疫器官,是机体抵抗外界致病性抗原的第一道防线。此外,肠道中定植大量与机体共生的微生物群体也可以通过多种不同的途径影响肠黏膜免疫的功能。本课题通过水提醇沉法获得GLP,用盐酸降解制备得到灵芝多糖水解物(the degradation of ganoderma lucidum polysaccharides,DGLP)。通过检测分子量、还原糖含量、红外吸收光谱、单糖组成等对灵芝多糖及其水解物进行表征;通过小鼠实验比较了 GLP、DGLP对环磷酰胺(cyclophosphamide,CY)诱导的免疫抑制小鼠肠黏膜免疫及系统免疫功能的影响;利用离体肠模型探究灵芝多糖对肠黏膜SIgA、IL-4分泌的影响。该课题为阐明灵芝多糖通过胃肠道发挥其药理作用的相关机制奠定了基础。(1)灵芝多糖及其水解物的制备与表征用水提醇沉法制备灵芝粗多糖,经过除蛋白、透析等步骤最终得到GLP(45.95%),HCl降解法(80℃、5 h)制得DGLP。3,5-二硝基水杨酸法(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)检测还原糖含量分别为8.02%和13.07%。凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography,GPC)测得 DGLP 的分子量比 GLP 降低一个数量级,GLP的数均分子量范围为84 Da-23269 Da,重均分子量分布范围为114 Da-76347 Da,Z均分子量范围为113 Da-222865 Da;DGLP的数均分子量范围为87 Da-2409 Da,重均分子量分布范围为126 Da-5292 Da,Z均分子量范围为150 Da-23956 Da。红外光谱结果显示,GLP和DGLP有部分特征吸收峰的差异,DGLP中含α-吡喃葡聚糖。单糖组成及其相对含量变化结果显示,GLP和DGLP在单糖组成上无差异,但各种单糖的相对含量存在明显差异。(2)灵芝多糖及其水解物对免疫抑制小鼠肠黏膜免疫功能的影响用CY诱导免疫抑制小鼠模型,以盐酸左旋咪唑为阳性药,观察GLP、DGLP治疗效应。①灵芝多糖及其水解物对肠黏膜免疫的影响:通过检测肠黏膜机械屏障、免疫相关因子等指标观察灵芝多糖及其水解物引起的肠黏膜免疫效应。实验结果表明,GLP、DGLP均能改善免疫抑制小鼠小肠组织形态、小肠绒毛长度(V)、隐窝深度(C)、V/C,增加肠黏液中IL-2、IL-4、IFN-y、SIgA、黏蛋白、溶菌酶的含量以及粪便中SCFAs含量。其中,SCFAs含量结果中,GLP作用效果要优于DGLP(p<0.01)。结果显示,灵芝多糖可以增强免疫抑制小鼠的肠黏膜屏障功能。②灵芝多糖及其水解物对系统免疫的影响:通过检测系统免疫相关指标,GLP、DGLP均能改善免疫抑制小鼠的脏器指数、PPs数量、盲肠重量及盲肠指数,增加血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、IgA含量,降低LPS含量。结果显示,灵芝多糖可以增强免疫抑制小鼠的系统免疫功能,但GLP和DGLP的作用效果无显著差异。(3)用于肠黏膜免疫功能检测的离体肠模型的建立将离体肠模型用于探究肠黏膜免疫的研究。通过用LPS、盐酸左旋咪唑、Gln处理离体肠,探究了离体肠培养的最适宜条件及对肠黏膜免疫的影响。①用LPS处理离体肠不同时长,随着时间的增加,培养液颜色变黄,肠管的活性逐渐消失,IL-4含量逐渐降低。最终确定0.5 h为最适宜时间。②用不同浓度的LPS、盐酸左旋咪唑、Gln分别处理离体肠。结果显示,LPS、盐酸左旋咪唑、Gln对肠黏膜免疫具有调节作用。但LPS、盐酸左旋咪唑的作用效果具有显著性。提示,离体肠模型可以用于肠黏膜免疫功能检测的研究。(4)灵芝多糖及其水解物对离体肠黏膜免疫功能的影响①用GLP和DGLP培养离体肠0.5 h后,检测SIgA的含量。结果表明,GLP、DGLP均可促进SIgA的分泌。②用在体实验中收集到的GLP-H组的肠内容物处理离体肠0.5 h后,检测SIgA的含量。结果显示,肠内容物同样可以促进SIgA分泌量的增加。结论:GLP、DGLP均能不同程度的恢复免疫抑制小鼠的肠黏膜免疫功能、系统免疫功能,但二者的作用效果无显著差异。离体肠实验结果表明,灵芝多糖可以直接刺激肠相关细胞分泌SIgA,也可以通过影响肠道菌群的代谢产物SCFAs的含量间接促进SIgA的分泌量进而调节肠黏膜免疫。本研究中,首次将离体肠模型用于肠黏膜免疫的研究中,相比于在体实验,可以排除肠道菌群对肠黏膜免疫的影响,检测灵芝多糖对肠黏膜免疫功能的调节方式,验证灵芝多糖对肠黏膜免疫的直接调节作用;其次可以用肠内容物处理离体肠,因肠内容物中含有大量肠道菌群的代谢产物,检测肠道菌群对肠黏膜免疫功能的调节方式,验证灵芝多糖对肠黏膜免疫的间接调节作用。基于以上实验结果推论:灵芝多糖对肠黏膜免疫功能的调节方式可能有明确的调节作用,即可以直接作用于肠道相关细胞发挥作用增强肠黏膜免疫功能。本研究为阐明灵芝多糖的“扶正固本”机制提供了新的实验证据。