研究背景胃癌(Gastric cancer, GC)是最常见的恶性肿瘤之一,常用的GC治疗方法如手术、放疗和化疗效果有限,GC的预后相当差。因此,继续探索GC的替代治疗方法是至关重要的。目前,中药里的有效成分,如紫杉醇、足叶草毒素、长春花碱和喜树碱等,已经被分离出来并用作癌症化疗药物。番荔枝科,也称为番荔枝家族或刺果番荔枝家族,有大约120属和2000-2200种,是木兰目最大的家族。整个番荔枝科植物、果实或种子作为传统药物被广泛应用于疼痛、发烧、腹泻、低血压、内部和外部寄生虫感染等治疗。番荔枝内酯(Annonaceous acetogenins, ACGs)是从番荔枝科植物中提取的一类脂肪酸衍生物,1982年第一个ACGs化合物uvaricin被提取出来,其在体内抗白血病作用引起了天然产物和药物化学家对这类化合物广泛的兴趣。ACGs表现出广泛的生物特性如细胞毒性、抗肿瘤、抗疟疾、抗菌、抗病毒、抗吞噬、驱虫、杀虫和免疫抑制活动等许多潜在作用。ACGs强大的细胞毒性和抗肿瘤活性是继紫杉醇后另一个“明日抗癌之星”。Notch信号通路作为进化上保守的信号通路,参与多种细胞过程包括细胞的命运、分化、增殖和细胞凋亡。此外,Notch信号组件如配体、受体和下游蛋白质与肿瘤形成有关。Notch信号在哺乳动物中包括四个受体(Notch 1-4)和五个配体[Delta-like配体1/3/4(DLL1/3/4)和Jagged(1/2)]。配体结合相应的受体后,Y-分泌酶复合体水解酶切受体跨膜域释放受体胞内域(Notch intracellular domain, NICD),然后NICD转入细胞核,形成转录辅激活物来调节下游靶基因Hes和Hey家族的表达。显然,根据肿瘤类型和细胞生长环境不同,Notch受体的激活可以致癌或抑癌。例如,Notch在结直肠癌、乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤中有致癌作用,而在皮肤鳞状细胞癌、宫颈癌、肝细胞癌、肺癌、胃肠道癌和神经内分泌肿瘤中有肿瘤抑制作用。目前,已经有大量的研究探讨了人类Notch信号通路和GC之间的联系。然而,Notch信号通路在GC中的作用仍然存在争议。Notch1被发现在大多数GC细胞系以及正常胃粘膜细胞有表达,但也有其他数据表明,在正常胃粘膜细胞没有表达。Du等的meta分析表明Notch1在GC和正常胃粘膜细胞中有表达,且在癌细胞中表达明显高于正常胃粘膜细胞,表明Notch1在GC中被激活,符合Notch1在许多恶性肿瘤中具有致癌基因作用。Sun等发现Notch2在GC中不仅表达量上升,而且其蛋白胞内段的核转移及相应下游基因Hes1的表达频率在体内外检测中均高于Notch1蛋白,说明Notch2信号在GC致癌作用和发展中更为重要。Zeng等人证明Notch2通过激活环氧化酶-2(COX-2)促进GC细胞增殖和异种移植肿瘤的生长。相反,Guo等人表明Notch2作为一个肿瘤抑制基因可能负调控人类GC细胞的入侵。所以,Notch家族的多面性特征提示检查其在特定肿瘤类型中的特定激活模式和潜在的作用方式是必要的。迄今为止,Notch2信号通路在ACGs的抗肿瘤活性中的作用还没有被研究。其中,Notch2胞内域(Notch2 intracellular domain, N2ICD)起着在细胞内信号传导的作用。在本研究中,将ACGs作用于GC细胞,并检测ACGs对细胞增殖的影响,探讨ACGs是否通过Notch2信号通路发挥抗肿瘤作用。本课题以GC细胞株AGS和MKN-45为研究对象,通过ACGs作用于GC细胞来开展以下几个方面研究：1、N2ICD的克隆和真核表达：构建真核重组质粒N2ICD/pCMV-Tag4并转染HEK 293T细胞进行表达,用于后续N2ICD/pCMV-Tag4转染GC细胞进行过表达研究；2、N2ICD的原核表达与纯化：构建原核重组质粒N2ICD/pGEX-4T-1,并在E.coli BL21中表达,用于后续pull-down实验,获取与N2ICD相互作用的蛋白并进行后续研究；3、ACGs介导的Notch2信号通路抑制胃癌细胞的增殖：将ACGs作用GC后,检测其对GC细胞的增殖、凋亡、细胞周期以及Notch2信号通路变化的影响。另外,通过过表达Notch2和Notch2-siRNA干扰进一步证明Notch2对GC细胞增殖的影响,为GC治疗提供了一个新策略。目的探索ACGs是否介导Notch2信号通路来实现对人GC细胞的增殖抑制作用的。方法1、通过在PubMed上查阅文献,获知人宫颈癌细胞Hela细胞中Notch2高表达。根据Genbank上Notch2的NICD序列设计引物,采用RT-PCR的方法从Hela细胞扩增人Notch2受体胞内区基因(N2ICD基因),酶切和测序鉴定并通过Blast进行比对,然后克隆入携带FLAG标签的真核表达载体pCMV-Tag4并进行瞬时转染HEK 293T细胞,通过Q-PCR和Western Blot方法检测目的蛋白N21CD的表达；2、根据GenBank上N2ICD基因序列设计引物,应用PCR方法从真核重组质粒N2ICD/pCMV-Tag4中扩增目的基因,酶切后克隆至携带谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签的pGEX-4T-1原核表达载体中,将重组质粒N2ICD/pGEX-4T-1转化至E.coli BL21菌株中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物,菌体经反复冻融,溶菌酶破菌,超声破碎后,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达形式,可溶性表达产物经谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B进行层析纯化,用Western Blot鉴定纯化产物。3、通过MTS实验检测ACGs对GC细胞增殖的影响,流式细胞术鉴定ACGs对GC细胞凋亡、细胞周期的影响。此外,Western Blot鉴定ACGs作用GC细胞后Notch2蛋白及下游蛋白Hes1的表达。通过过表达Notch2和Notch2-siRNA干扰进一步证明ACGs是否介导Notch2信号通路影响GC细胞的增殖。结果以Hela细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增N2ICD cDNA片段,克隆入真核表达载体pCMV-Tag4,成功构建真核重组质粒N21CD/pCMV-Tag4,将其转染HEK 293T细胞,Q-PCR和Western Blot检测发现N2ICD表达成功。以N2ICD/pCMV-Tag4为模板,PCR扩增N2ICD片断,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,成功构建原核重组质粒N2ICD/pGEX-4T-1,并转化E.coli BL21中,破菌后上清和沉淀中都有目的蛋白的表达,用亲和层析纯化破菌上清,Western Blot鉴定纯化产物,表明GST-N2ICD融合蛋白表达成功。通过Q-PCR对胃正常胃粘膜上皮细胞GES-1以及6株GC细胞株AGS、 MGC-803、SGC-7901、MKN-28、MKN-45进行Notch2 mRNA水平进行检测,发现与GES-1相比,Notch2在AGS和SGC-7901高表达,在MGC-803、MKN-28和MKN-45中低表达,从中选出代表细胞株AGS和MKN-45用于后续研究。用ACGs刺激GC细胞24h后发现ACGs抑制GC细胞的增殖,且对两株细胞的IC50值都接近5.0μg/mL。以2.5、5、10μg/mLACGs分别作用GC细胞12、24、36h,发现ACGs对GC细胞的生长增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性。用5.0μg/mLACGs作用GC细胞12、24、36h,以及2.5、5、10μg/mLACGs作用GC细胞36h后,发现ACGs可诱导GC细胞凋亡并具有时间和剂量依赖性。同时,2.5、5、10μg/mLACGs作用GC细胞36h后,使GC细胞周期停留在G0-G1期,进一步证实ACGs具有抑制GC细胞增殖的作用。另外,以2.5、5、10μg/mLACGs作用GC细胞36h后,Notch2表达水平升高并具有剂量依赖性。用N2ICD/pCMV-Tag4转染GC细胞进行过表达N2ICD,发现ACGs抑制GC细胞增殖的作用加强。相反,Notch2-siRNA转染GC细胞干扰N2ICD的表达,发现ACGs抑制GC细胞增殖的作用减弱。结论ACGs抑制GC细胞的增殖、诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期于G0-G1期。ACGs作用于GC细胞后Notch2的表达上调并具有剂量依赖性。过表达Notch2增强ACGs抑制GC细胞增殖的作用,Notch2-siRNA干扰则降低ACGs的细胞毒作用。因此,ACGs可能通过直接或间接激活Notch2信号来发挥其抗肿瘤作用。