雌性大鼠原始卵泡的形成发生在出生后,从刚出生时卵巢中卵母细胞巢开始发育,相当一部分卵泡在不同发育阶段相继退化闭锁,而另一部分到初情期前形成部分有腔卵泡。其中有两个方面的重要现象目前引发了人们极大地研究兴趣：1.卵母细胞巢如何裂解形成原始卵泡,并且在初情期前形成有腔卵泡。2.初情期前卵泡退化闭锁的影响因子是什么、其调控机制又是怎样?NO/cGMP信号通路在雌性动物生殖生理过程中起着非常广泛的调节作用,诸如介导卵泡闭锁,类固醇,前列腺素的合成,排卵,卵母细胞的生长和成熟卵巢功能等。目前,还没有研究报道NO/cGMP信号通路在新生雌性大鼠卵泡发育过程中的生物学作用及其可能的调控机制。本研究采用组织形态学(HE)、免疫组织化学(IHC)、RT-PCR、免疫印迹(Western blot)等生物化学分子生物学研究技术,全面研究NO/cGMP信号通路在新生雌性大鼠从出生到初情期前卵泡发育过程中的生物学作用和调控机制。其主要发现和结论如下：1.探讨三种不同的一氧化氮合酶(NOS)亚型在细胞内的表达以及相关的一氧化氮(NO)/环磷酸鸟苷(cGMP)的信号通路在新生和初情期前的雌性大鼠卵巢中的变化。发现,在出生后1天,5,7,10和19天,所有三个亚型的NOS,主要定位于各阶段卵泡的卵母细胞中,并在颗粒细胞和卵泡膜细胞内的增长逐步增加。卵巢总NOS活性和NO水平与其他在产后7日和10日相比,呈显著性增加。与内皮型NOS(eNOS)的,诱导型NOS (iNOS)相比,神经型NOS(nNOS)的活性则保持较低水平。我们的研究结果表明,内源性NOS/cGMP信号系统参与新生雌性大鼠卵泡发育。2.采用RT-PCR法检测和半定量分析11种cGMP相关磷酸二酯酶在新生雌性大鼠卵巢发育过程中(出生后1,5,7,10,19天)的表达变化。结果发现：只有PDE1A, PDE3A, PDE3B, PDE5A, PDE9A有表达,其它酶类均无表达。进一步的半定量分析,PDE5A, PDE3A是主要表达的酶类。两者在出生后第一天表达较低(p<0.05),但是其余时间点表达稳定,cGMP相关磷酸二酯酶的表达在5天后趋于稳定。这就说明PDE5A, PDE3A参与了新生雌性大鼠卵巢发育并对cGMP起着主要的调控作用。3.建立体内的一氧化氮合成酶抑制模型,然后组织学观察统计分析不同处理组卵泡发育的动力学变化。我们发现,处理5,10,19天后,L-NAME+SMT处理组,其卵巢中卵泡发育缓慢,在19天时,有腔卵泡数目显著减少(p<0.05),而L-Arg组则呈现提早发育,其有腔卵泡数目显著增加(p<0.01)。进一步检测各处理组总NOS、三种NOS亚型的活性和NO含量,发现,L-NAME+SMT处理组上述指标显著下降(p<0.05),而L-Arg组则显著上升(p<0.01)。但是NOS抑制剂单处理组则与对照差异不显著。研究结果表明NOS参与了新生雌性大鼠的卵巢卵泡发育,并且促进卵泡的提早发育。4.采用免疫组化、免疫印迹(Western blot)探讨NOS促进卵泡的提早发育的可能机制。免疫组化显示,PI3K/AKT/FoxO3a信号通路主要蛋白PTEN、AKT和FoxO3a在新生雌性大鼠卵泡发育过程中,主要定位于卵母细胞,在出生后19天时,在颗粒细胞也有部分表达,而且其免疫染色增强。进一步的免疫印迹分析,发现：NOS抑制剂L-NAME+SMT处理5,10,19天组,与对照相比,P13K/AKT/FoxO3a信号通路,PTEN表达上升,p-AKT、p-Fox03a表达显著下降。而NOS的底物(L-Arg)处理5,10,19天组,其PI3K/AKT/FoxO3a信号通路激活,即：PTEN表达显著下降,p-AKT、p-FoxO3a表达显著上升。此外,同一处理时间,单注射NOS抑制剂L-NAME或sMT处理组与对照相比则没有显著变化。上述发现说明NOS参与了新生雌性大鼠的卵巢卵泡发育,并且可以通过P13K/AKT/Foxo3a信号通路促进卵泡的提早发育。5.采用免疫组化、免疫印迹(Western blot)探讨NOS是否通过细胞自噬和凋亡参与新生雌性大鼠卵巢发育。结果发现,凋亡标记蛋白(Caspase-3)和自噬标记蛋白(LC3)在新生大鼠卵巢普遍分布,从出生5天后,主要分布在颗粒细胞,卵母细胞,膜细胞等,进一步的WB检测,NOs抑制剂L-NAME+SMT处理5,10,19天组,与对照相比,LC3-Ⅱ表达下降,Cleaved-caspase-3表达显著上升。而NOS的底物(L-Arg)处理5,10,19天组,其LC3-Ⅱ表达上升,Cleaved-caspase-3表达显著下降。此外,同一处理时间,单注射NOS抑制剂L-NAME或SMT处理组与对照相比则没有显著变化。上述结果证实NOS通过细胞自噬和凋亡参与新生雌性大鼠卵巢发育。