论文部分内容阅读
由于小麦生长环境和采后储藏等的影响,我国面粉的加工品质并不能完全满足我国面粉加工业的需求。通过添加面粉改良剂能改善面粉加工品质,以小麦内源酶为主体的面粉改良酶制剂已成为面粉加工行业发展的重要方向。本文应用原核和真核表达体系重组表达小麦过氧化氢酶（WCAT1）,在研究WCAT1酶学性质基础上,进一步探讨了WCAT1对面粉加工品质的改善作用。主要研究内容和结论如下:（1）wcat1基因的克隆及生物信息学分析。从小麦黄化苗叶片中成功克隆了wcat1基因,测序后对wcat1基因及其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。wcat1基因含有1479个碱基,其编码的WCAT1属于过氧化氢血红素结合蛋白质超家族成员,是潜在的具有丰富的N-糖基化位点的亲水性蛋白质,与同为禾本科的水稻、小米、高粱来源的CAT的亲缘关系较近。（2）WCAT1的异源重组表达。利用大肠杆菌原核表达体系和毕赤酵母真核表达体系,实现了WCAT1在大肠杆菌和毕赤酵母中的异源重组表达。大肠杆菌表达的胞内目的蛋白以不可溶的包涵体形式存在,毕赤酵母表达的胞外目的蛋白具有生物活性。以发酵液中WCAT1的酶活性为目标,优化了毕赤酵母重组表达WCAT1的条件,其最适表达条件为:甲醇终浓度1%（v/v）,诱导表达时间84 h,诱导表达培养基pH 6.0,诱导表达培养基装液量10%（v/v）,诱导起始菌液OD60000 2.0,在此条件下发酵上清液中的酶活为1233±56 U/m L。（3）WCAT1的纯化及酶学性质研究。利用硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱层析获得了电泳纯WCAT1。WCAT1的最适反应温度为35℃,最适反应pH为7.0,WCAT1在低温中性条件下稳定性较好。Fe3+对WCAT1酶活性有一定促进作用,而Zn2+、Cu2+、Mg2+和Fe2+则抑制其酶活性;EDTA、SDS、吐温20和TritonX-100能明显抑制WCAT1的活性。WCAT1催化过氧化氢分解的米氏常数Km值为18.95 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.22μmol/min。（4）WCAT1对面粉加工品质的影响。利用粉质仪、流变仪、扫描电镜和质构仪考察了WCAT1对面粉加工品质的影响,并初步探究了WCAT1改良面粉加工品质的机制。单独添加3000 U/g面粉的WCAT1能显著提高面粉的粉质特性,其稳定时间从2.85 min提高到4.15 min;提高面团的粘弹特性、面包的比容以及降低面包的硬度、胶粘性和咀嚼性。WCAT1改善面粉加工品质的原因与其能够强化面筋网络结构和提高面筋蛋白大聚集体（GMP）的含量有关。