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核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是催化光合碳同化(CO2固定)第一步反应的一个关键酶,在调控光合作用效率方面发挥重要作用。在植物体内Rubisco的激活需要氨甲酰化并与二价镁离子结合,Rubisco激活酶(RCA)是一种叶绿体定位酶,催化Rubisco的激活反应。很多研究表明甲醇和乙醇的应用促进植物的生长,甲醇的施用促进模式植物烟草和拟南芥的生长效果已经得到反复的证实,而乙醇的施用刺激植物生长的效果同样也得到了一些研究的证实。本实验室之前的研究表明甲醇的应用显著诱导RCA的表达,故本研究分析RCA启动子含有不同元件的DNA片段及与之结合的转录因子对甲醇和乙醇刺激的应答,并且通过比较RCA的突变株(rca)和野生型(WT)拟南芥应答甲醇和乙醇刺激的几种生理生化指标及光合相关基因转录水平的变化来研究RCA应答甲醇乙醇刺激的机理,取得如下的结果：利用rca基因启动子330bp和983bp两个DNA片段分别构建植物表达载体构建pKm-Prca330-luc及pKm-Prca983-luc,控制报告基因luc的表达,用这两个表达载体转化烟草获得转基因植物。分析转基因烟草中luc的转录和LUC蛋白的表达对甲醇和乙醇刺激的应答,结果表明rca启动子330片段和983片段控制luc的转录和翻译都能对甲醇和乙醇刺激产生应答,只是应答的模式不同,330片段控制luc的表达做出的应答反应发生在甲醇和乙醇处理的72小时,而983片段控制luc的表达的应答反应发生在甲醇和乙醇处理的12小时,说明983片段所含有的启动子元件对甲醇和乙醇刺激的应答速度快于330片段。用RT-PCR分析拟南芥中rca启动子上不同DNA元件结合的转录因子(ARF1/ARF7:生长素应答因子；ASF-1/ASF-2：生长素或水杨酸应答因子；LCR1：Myb转录因子；GAmyb:赤霉素调控转录因子;WRKY71:GA信号途径的一种转录阻遏物)在甲醇和乙醇处理后的表达谱,结果说明ASF-1和ARF7的转录都能对甲醇和乙醇的刺激产生应答,且应答模式与RCA的相似,说明这两种转录因子可能是调控RCA的转录应答甲醇和乙醇刺激共有的转录因子。LCR1和WRKY71的转录仅对甲醇的刺激产生应答,GAmyb的转录仅对乙醇的刺激产生应答,说明这些转录因子可能是调控RCA的转录应答甲醇或乙醇刺激特异的转录因子。比较rca突变体和WT拟南芥在含有蔗糖MS培养基的生长应答甲醇和乙醇刺激的效果,结果说明甲醇刺激促进rca的生长效果与WT相似,说明rca和WT的生长应答甲醇刺激的能力相同,但乙醇刺激促进rca的生长效果比WT差,说明rca的生长应答乙醇刺激的能力低于WT。分析生长在含有蔗糖和高浓度(3%)葡糖糖MS培养基上的rca和WT花青素和叶绿素含量变化对甲醇和乙醇刺激的应答,结果说明在蔗糖培养基上生长时rca和WT花青素含量变化对甲醇和乙醇刺激的应答模式相同：甲醇的存在使二者花青素含量减少,乙醇的存在使二者花青素含量增加；但rca和WT叶绿素a和b含量变化对甲醇和乙醇刺激的应答模式不同：甲醇和乙醇的存在都减少WT叶绿素a和b的含量,但却使rca叶绿素a和b的含量增加。在葡糖糖培养基上生长时,甲醇和乙醇的存在使WT的花青素含量减少,使rca的花青素含量增加；甲醇和乙醇的存显著减少WT叶绿素a的含量,不改变WT叶绿素b的含量,但显著增加rca叶绿素a含量的同时减少其叶绿素b的含量。用RT-PCR分析rca和WT光合相关基因应答甲醇和乙醇刺激的表达谱,结果说明rca和WT卡尔文循环相关基因如FBP/SBP、rbcS的转录应答甲醇和乙醇刺激的模式相同：这些基因的转录都被可被甲醇和乙醇上调,但rca和WT叶绿素a／b结合蛋白(CAB)的转录应答甲醇和乙醇刺激的模式不同。用13C-NMR分析甲醇和乙醇对rca和WT中NaH13CO3代谢谱的影响,结果显示甲醇和乙醇的存在促进rca中NaH13CO3同化为[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc的效果小于WT；二者[3-13C]Ser的合成对甲醇和乙醇的应答模式相同：甲醇减少rca和WT中[3-13C]Ser的产生,乙醇增加rca和WT中[3-13C]Ser的产生；二者[U-13C]Glu的合成对甲醇和乙醇的应答模式相同：甲醇和乙醇都增加[U-13C]Glu的合成,二者[U-13C]Gln的合成对甲醇和乙醇的应答模式不同：甲醇和乙醇对WT中[U-13C]Gln的合成没有影响,但却增加rca中[U-13C]Gln的合成。