论文部分内容阅读
具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum）是一种已知的革兰阴性厌氧的牙周致病菌,与多种人类疾病有关,包括牙周病、口腔癌、炎症性肠病和结直肠癌等。口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma,OSCC）是发生于表皮或附属器细胞的一种恶性肿瘤,是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。舌鳞状细胞癌（Tongue squamous cell carcinoma,TSCC）是OSCC最常见的分型之一。顺铂（Cis-diaminodichloroplatinum,CDDP）是一种作用于DNA的抗癌药物,广泛应用于鳞癌治疗。OSCC术后五年生存率仅为50-60%,这与OSCC的耐药性相关。随着宏基因组学的发展,研究发现OSCC患者体内F.nucleatum的丰度不仅明显高于健康人,且随着癌症分期越高,丰度呈梯度上升。本研究以TSCC小鼠模型和细胞系Cal-27和HSC-3为研究对象,通过体内外实验探索F.nucleatum对人TSCC生物学行为的影响,特别是CDDP抗性和迁移能力,并挖掘其相关机制。目的:前期实验检测F.nucleatum与Cal-27和HSC-3共培养后NOTCH、MAPK、NF-κB及WNT通路因子的表达,结果显示WNT通路因子上调。构建TSCC小鼠模型,体内外实验检测F.nucleatum对TSCC细胞系Cal-27和HSC-3的生物学影响,特别是与预后相关的迁移与CDDP抗性,并探索WNT通路参与的作用机制。方法:选取TSCC细胞系Cal-27和HSC-3,用不同浓度的F.nucleatum处理对数期细胞,实验分为处理组（MOI=100,200,500,1000）和未处理组（MOI=0）。用CCK-8法评估F.nucleatum对细胞增殖和黏附能力的影响。构建CDDP耐药细胞株Cal-27/CDDP,在10μM的CDDP刺激下,通过CCK-8、流式检测线粒体膜电位和caspase3/7活性评估细胞的凋亡水平,Western blotting检测内源性凋亡相关蛋白BAX/BCL-2和P53的蛋白水平。用皮下注射Cal-27/CDDP的方法构建癌症小鼠模型,腹腔注射CDDP,实验组瘤体注射F.nucleatum,比较F.nucleatum处理组和未处理组肿瘤大小和质量。镜下观察F.nucleatum处理的Cal-27和HSC-3细胞形态,划痕实验和Western blotting检测细胞迁移水平。通过Real-time PCR筛选WNT通路因子,用Western blotting和荧光素酶检测WNT通路相关关键因子水平。用慢病毒感染Cal-27和HSC-3细胞敲低NFATc3表达,观察细胞形态、划痕实验结果和E-cadherin蛋白表达,反向验证迁移水平的变化。使用NFAT拮抗剂VIVIT,检测凋亡蛋白表达,反向验证CDDP抗性水平的变化。结果:不同浓度的F.nucleatum处理对数期Cal-27和HSC-3细胞,CCK-8结果显示,处理组和未处理组细胞增殖水平无明显差异,处理组30 min黏附的细胞数目较未处理组更多,且MOI=500时达到峰值。在CDDP的刺激下,CCK-8、线粒体膜电位和caspase 3/7活性检测Cal-27/CDDP和HSC-3的结果显示,处理组细胞存活率更高,且在MOI=500时达到峰值,此时线粒体膜电位降低更少,caspase 3/7活性更低,差异有统计学意义。癌症小鼠模型结果显示F.nucleatum处理组小鼠的肿瘤大小和质量均大于未处理组,差异有统计学意义。Western blotting结果表明MOI=500时内源性凋亡蛋白BAX/BCL-2和P53表达降低。镜下可见MOI=500时,Cal-27和HSC-3细胞由上皮样圆形变成纤维细胞梭形,划痕实验和蛋白结果示处理组细胞迁移面积更大,迁移距离更长,迁移相关蛋白E-cadherin表达下调。Real-time PCR和Western blotting结果表明F.nucleatum上调了WNT5A在Cal-27和HSC-3的转录水平,激活了非经典WNT/Ca2+通路,且通过NFATc3下调了P53和E-cadherin。用慢病毒感染Cal-27和HSC-3敲低NFATc3表达,F.nucleatum引起的Cal-27和HSC-3细胞形态、划痕实验结果以及E-cadherin的下调被逆转。在NFAT抑制剂VIVIT和CDDP的作用下,F.nucleatum处理的Cal-27/CDDP和HSC-3细胞存活率和内源性凋亡蛋白BAX/BCL-2及P53的表达与未处理组无明显差异,比无抑制剂处理组显著降低。结论:综上所述,F.nucleatum可能促进TSCC细胞系Cal-27和HSC-3迁移、黏附和CDDP抗性,而不影响细胞增殖。WNT5A/NFATc3通路是F.nucleatum促进Cal-27和HSC-3迁移和CDDP抗性可能机制之一。