研究背景：肺癌是当前世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一，发病率呈不断上升趋势，并已成为目前人类因癌症死亡的主要原因。虽然近年来化学治疗、放射治疗和外科治疗手段不断进步，但肺癌患者总体生存率仍然没有明显的改善，5年生存率不到15％。目前受人瞩目的生物治疗被认为是除手术、放疗、化疗之外的“第四模式”，其原理主要是通过导入外源性相关反义基因、生物小分子干扰甚至抑制肿瘤的生长，或调动机体的自然防卫机能或促进自身产生的某些物质来取得诱导肿瘤细胞自身生长的停滞或凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。免疫治疗是目前生物治疗肿瘤极有前景的治疗手段之一。研究表明，机体对肿瘤的免疫主要通过T细胞特异性杀伤来实现；而有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），是实现肿瘤主动免疫治疗的关键。树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前发现的体内功能最强、也是唯一能激活初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞，它能高水平的表达与抗原提呈有关的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，并可高水平的表达多种共刺激分子及某些粘附分子。DC细胞可摄取肿瘤特异性相关抗原，吞噬处理凋亡或坏死肿瘤细胞等颗粒性抗原，具有“交叉提呈（cross-presentation）”外源性抗原的能力。通过DC对肿瘤抗原的高效提呈作用，激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应成为肿瘤免疫治疗的一个热门课题；而为DC疫苗寻找特异性的肿瘤抗原、探索最佳的加载途径成为目前研究的一大方向。目前肿瘤特异性抗原加载修饰DC的方法有很多。最常见的途径包括：肿瘤细胞裂解产物刺激、肿瘤来源的MHCⅠ类限制性多肽加载等。但采用整个肿瘤细胞作为抗原相对较为困难，因为标准的不统一，而且部分情况下肿瘤细胞的获得较为不易；而采用多肽需要明确特异的HLA表型。近来的研究结果表明肿瘤相关抗原cDNA修饰DC可以有效诱导肿瘤相关抗原特异性的免疫反应，并且具有其独特的优点，诸如：能提呈多种已知和未知的肿瘤相关抗原表型，内源性肿瘤相关抗原的处理提呈可能比外源性合成多肽的加载更有效。而基因修饰DC目前最常采用和最有效的方法为腺病毒载体。DNp73α由p53家族的成员p73基因经位于第3内含子的启动子启动，经过不同于P73的方式剪切，所生成N’端缺失的蛋白。DNp73α在正常组织细胞不表达，但在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌以及成神经细胞瘤等肿瘤细胞中高表达。并对野生型P53和P73产生竞争性抑制其作用。多个研究表明，DNp73a的高表达，是肿瘤较差预后的重要独立因素，是肿瘤生物治疗重要的分子靶点。但目前鲜有针对DNp73α靶点生物治疗的研究报道。在本研究中我们通过设计含有DNp73α全长cDNA的重组腺病毒，并将其转染修饰DC，来诱导针对高表达DNp73α的肿瘤细胞的特异CTL反应，为后续的动物及临床实验研究提供依据。研究方法：1．采用AdEasy系统构建携带HA标记含人全长DNp73αcDNA的复制缺陷型重组腺病毒Adv-DNp73α，即：从pcDNA3.0-DNp73α-HA中酶切出DNp73α基因，并定向克隆插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV-DNp73α经PmeI线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的E．coli BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacI线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增。携带绿色荧光标记的Adv-EGFP作为实验对照。2．人脐带血经梯度离心法和细胞因子IL-4、GM-CSF诱导培养的树突状细胞。通过增强离心法使DNP73α重组腺病毒有效转染DC，并通过追踪绿色荧光蛋白的表达，检测不同感染复数（M．O．I．）的转染效率以及腺病毒转染对细胞的毒性，来确定合适的感染复数；3．用RT-PCR和Western Blot检测受Adv-DNp73α转染48小时后DC胞内DNp73α的mRNA和蛋白表达；4．流式细胞仪检测Adv-DNp73α腺病毒转染后48小时DC表面分化成熟、活化标志物表达的变化。正常DC和Adv-EGFP转染组作为对照。5．Annexin V-PE染色分别检测Adv-DNp73α腺病毒转染后4天、8天和12天DC凋亡的水平。正常DC和Adv-EGFP转染组作为对照。6．采用尼龙毛柱法分离纯化同源T细胞。纯化的T细胞在96孔板中与经丝裂霉素C预处理的各种DC共培养5天。结束培养前8小时加入1μCi／孔的³H胸腺嘧啶脱氧核苷。收获细胞后，放射性荧光闪烁计数仪检测每分钟放射性荧光闪烁计数值。7．Real Time PCR对比分析A549／DNp73α肺腺癌细胞株、人慢性髓细胞白血病细胞K-562细胞株和人乳腺癌细胞株MCF-7细胞中DNp73αmRNA的表达水平；CytoTox 96 non-radioactive cytotoxicity assay检测不同效应细胞（细胞毒性T淋巴细胞CTL、普通T细胞以及淋巴因子活化的杀伤细胞LAK）针对不同DNp73α靶细胞（A549／DNp73α、K-562、MCF-7）的杀伤效应。8．统计分析：数据采用（?）±SD表示；对于正态分布数据，组间比较采用t检验。非正态分布数据采用秩和检验分析。p＜0.05认为有显著统计学差异，p＜0.01认为差异非常显著。所有数据采用统计学软件SPSS10.0分析。结果：1．采用定向克隆以及同源重组在293T细胞内产生了具有转染能力的腺病毒颗粒；通过反复感染，获得较高滴度腺病毒液(约2.5×10¹¹pfu／L)；2．从人脐静脉血中培养出DC。光镜以及扫描电镜观察到所诱导DC具有不规则形状和典型的多个树突样突起；流式细胞仪证实典型表面分子表达CD1a⁺，CD83⁺，and HLA-DR⁺；3．采用M．O．I 200的病毒液转染48小时后，DC的转染效率达到80％以上，并且细胞具有较高活力。携带DNp73αcDNA的重组腺病毒转染DC，使DNp73αmRNA和蛋白的表达显著增加；并可以促进DC的分化成熟，即上调CD83和HLA-DR的表达。4．在重组腺病毒转染DC后4天、8天，三组细胞（即DNp73α、Adv-EGFP和正常DC组）生存率之间无显著差异；但转染后12天，DNp73α转染组生存率为71±2.83％，非常显著高于Adv-EGFP和正常DC组（分别为45.50±3.54％and53.52±0.71％，p＜0.01）。5．Adv-DNp73α、Adv-EGFP重组腺病毒转染DC后4天和8天，其刺激T淋巴细胞增殖能力均非常显著高于正常DC（p＜0.01），但Adv-DNp73α、Adv-EGFP两组间无差异；在转染后12天，DNp73α修饰的DC刺激T淋巴细胞的增殖能力高于Adv-EGFP组（p＜0.01）。6．DNp73α特异性CTL能有效裂解A549／DNp73α细胞（DNp73a++）、K-562细胞（DNp73α+）；而MCF-7细胞（DNp73α—）仅少部分裂解。同时这种特异性CTL杀伤A549／DNp73α细胞的水平高于K-562细胞。而对比研究DNp73α特异的CTL、LAK和正常T细胞分别针对A549／DNp73α细胞、K-562细胞和MCF-7细胞的杀伤作用，发现DNp73α特异性的CTL针对A549／DNp73α细胞、K-562细胞的杀伤效应接近LAK的能力；LAK同样可以有效的杀伤MCF-7细胞，而DNp73α特异性的CTL仅少量裂解MCF-7。结论：DNp73αcDNA修饰的DC疫苗，能诱导针对DNp73α特异性的CTL，证实了DNp73α基因修饰DC疫苗治疗肺癌的可行性和有效性；同时携带DNp73αcDNA的重组腺病毒转染DC，可以抑制DC的细胞凋亡、延长DC的生存时间，提高刺激T细胞增殖的能力，该作用将有可能进一步提高针对DNp73α高表达肿瘤细胞的免疫杀伤作用。