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目的非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC）约占初发膀胱肿瘤的75%,主要的治疗手段是经尿道膀胱肿瘤切除术（trasnurethral resection of bladder tumor,TURBT）,术后建议行辅助性膀胱灌注化疗以降低膀胱癌复发率。然而,由于药物在膀胱内滞留时间短及膀胱粘膜糖胺聚糖（glycosaminoglycans,GAGs）屏障保护,化疗药物的临床效果严重受损。为了延长药物在膀胱内的滞留时间,提高药物对膀胱壁的渗透能力,改善药物对肿瘤组织的选择性,本课题制备了一种带正电具有还原响应性的寡聚精氨酸-聚（乙二醇）-聚（L-苯丙氨酸-co-L-胱氨酸）（oligoarginine-poly（ethyleneglycol）-poly（L-phenylalanine-co-L-cystine）,R9-PEG-P（LP-co-LC））,负载10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin,HCPT）。该载药纳米凝胶（R9NG/HCPT）显著改善了HCPT的水分散性,PEG链与膀胱粘膜之间的非特异性相互作用以及阳离子R9与带负电荷膀胱粘膜之间的静电相互作用,协同增强了R9NG/HCPT的粘膜粘附性能。此外,R9作为一种细胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides,CPPs）,可以有效地穿透细胞膜,并运送携带的药物。肿瘤细胞内还原微环境破坏R9NG/HCPT的二硫键,触发HCPT的选择性释放行为。通过协同提高膀胱癌灌注化疗药物的粘附、渗透及靶向性,持续杀伤肿瘤细胞,预防肿瘤复发,实现膀胱癌的有效治疗。方法第一部分:通过L-苯丙氨酸-N-环内酸酐（L-phenylalanine N-carboxyanhydride,LP NCA）和L-胱氨酸N-环内酸酐（L-cystine N-carboxyanhydride,LC NCA）的开环聚合/脱保护反应合成两亲性马来酰亚胺-聚乙二醇-聚（L-苯丙氨酸-co-L-胱氨酸）（MI-PEG-P（LP-co-LC））,随后,将末端为半胱氨酸的寡聚精氨酸（R9-cys）通过迈克尔加成反应修饰到MI-PEG-P（LP-co-LC）的马来酰亚胺末端,得到渗透能力进一步增强的R9-PEG-P（LP-co-LC）。PEG提供亲水段,且与膀胱粘膜发生非特异性相互作用改善粘附能力。P（LP-co-LC）为疏水性和还原响应性聚氨基酸,可高效载药并在肿瘤细胞内精准释放。通过纳米沉淀技术,将化疗药物HCPT分别载入R9-PEG-P（LP-co-LC）和MI-PEG-P（LP-co-LC）内核,制备R9NG/HCPT和NG/HCPT（即阴性对照）。系统表征所制备的载药纳米凝胶的理化特性,如载药性能、粒径、形貌、表面电位及其在不同还原浓度刺激下的粒径变化与稳定性,研究其还原响应性的释放行为。第二部分:采用激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）对R9NG/HCPT的细胞内吞和细胞内药物释放行为进行了定性研究。多功能酶标仪进一步定量地检测了细胞内吞和细胞内药物释放量。采用标准甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测R9NG/HCPT的潜在细胞毒性。流式细胞仪分析检测R9NG/HCPT诱导5637细胞发生凋亡情况。第三部分:通过CLSM检测R9NG/HCPT的粘膜粘附力、肿瘤渗透性。采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）法分析R9NG/HCPT的组织分布。构建C57Bl/6小鼠和SD大鼠原位膀胱肿瘤模型,系统评估R9NG/HCPT的抗肿瘤作用。采用膀胱造影术明确肿瘤的大小及膀胱癌的发展情况。监测实验动物体重以评价R9NG/HCPT的全身毒性。为进一步准确评价R9NG/HCPT的抗肿瘤活性,在膀胱灌注化疗结束后进行膀胱组织病理学检查和免疫组化染色。结果第一部分实验结果表明,在pH 7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）中,R9NG/HCPT的流体动力学半径（hydrodynamic radius,Rh）为48.9±0.7 nm,而NG/HCPT的Rh为44.8±1.3 nm。NG/HCPT的zeta电位为-17.27±0.8 mV,R9NG/HCPT的zeta电位为26.9±1.2 mV。R9NG/HCPT带正电进一步证明了R9成功结合在纳米凝胶的表面。此外,正电荷增强了R9NG/HCPT与带负电的细胞膜的相互作用,进而促进了细胞内化。R9NG/HCPT在生理条件下具有良好的稳定性。然而,在还原性微环境中,二硫键可被迅速破坏,导致肿瘤细胞选择性释放HCPT。第二部分实验结果表明,随着共培养时间的延长,R9NG/HCPT的内吞明显增强,细胞内HCPT的含量保持相对较高的水平。在6 h,R9NG/HCPT组细胞内HCPT浓度约为HCPT游离药组的1.9倍,约为NG/HCPT组的1.5倍。R9NG/HCPT对5637的细胞毒性优于HCPT游离药和NG/HCPT。R9NG/HCPT的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）为2.4±0.1μg mL-1,低于HCPT游离药(即8.7±0.8μg mL-1)和NG/HCPT(即4.7±0.2μg mL-1)。R9NG/HCPT引起细胞凋亡数最大。细胞凋亡率为22.5%。与之相反,用HCPT游离药和NG/HCPT孵育后,细胞凋亡率分别为12.2%和18.7%。第三部分实验结果表明,R9NG/HCPT对尿路上皮表面具有较高的粘附力和渗透力。相反,由于尿液的稀释和冲刷作用,HCPT游离药在膀胱内的荧光信号迅速下降。在0.5 h,R9NG/HCPT的荧光强度是HCPT游离药的1.6倍。当滞留时间从2 h延长到6 h时,荧光强度从2.2倍增加到4.8倍。随着时间的推移,R9NG/HCPT的荧光强度逐渐扩散到整个膀胱组织,并保持相对较高HCPT含量。R9NG/HCPT释放的HCPT主要积聚在膀胱内,是HCPT游离药的2.2倍。膀胱造影显示,最大的占位性病变出现在PBS治疗的膀胱中,而R9NG/HCPT组膀胱壁光滑,未见明显异常。R9NG/HCPT具有较好的抗肿瘤作用。经R9NG/HCPT治疗的实验动物在治疗期间体重稳定增加,表明R9NG/HCPT的全身毒性可忽略不计。PBS组膀胱切片可见大量癌细胞,细胞核为球形或梭形,具有明显的异型性。而用R9NG/HCPT治疗后,肿瘤细胞出现核固缩、色素凝集、凋亡小体和形态不清等现象,说明R9NG/HCPT具有抗肿瘤作用。caspase-3免疫组化染色显示R9NG/HCPT组有大量细胞经历凋亡。Ki-67的表达表明R9NG/HCPT明显抑制膀胱癌细胞的生长。结论1、成功合成了带正电具有还原响应性的R9-PEG-P（LP-co-LC）及载药纳米凝胶R9NG/HCPT;2、PEG协同R9增强R9NG/HCPT的粘膜粘附力,R9进一步促进了R9NG/HCPT对膀胱壁的穿透能力;3、还原响应性使R9NG/HCPT在肿瘤细胞内快速释放HCPT,维持较高细胞内药物浓度;4、R9NG/HCPT具有较好的抗肿瘤作用。