单体红色荧光蛋白基因DsRed2的克隆、原核表达特性及其生物信息分析

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本研究用从质粒pDsRed2-1中分离的红色荧光蛋白基因DsRed2构建了原核表达载体pGEX4T-1-DsRed2,进行了原核表达,并对目的蛋白的生物信息进行了分析,结果表明:  1、从质粒pDsRed2-1中分离的含有红色荧光蛋白基因DsRed2的目标DNA片段,序列长度为680bp,含有678bp构成的开放阅读框(ORF)。与参考序列Ref_DsRed2-DNA相比,所克隆的含有目的基因DsRed2的DNA片段在其ORF内,从起始密码子的第1个碱基起,下游第537个碱基由C突变为T,使第179个密码子从TCC(UCC)变为TCT(UCU),两者的序列一致性为99.85%。克隆的含有目的基因DsRed2的DNA片段在其ORF内存在的单碱基突变属于同义突变,所编码的目的蛋白氨基酸序列不变,序列一致性为100%。  2、目的基因DsRed2编码由225个氨基酸组成的蛋白RFP2;该蛋白属于荧光蛋白超级家族。该蛋白无信号肽,不涉及合成后的转运。  3、RFP2蛋白氨基酸序列包含5个疏水区和5个亲水区,前者都比较小、且由弱亲水部分所构成,而后者都很大、且由强亲水部分所构成;该蛋白亲水性氨基酸残基数量是疏水性氨基酸残基数量的2.2倍,其总亲疏水性值为-129.9;该蛋白的氨基酸序列经高级折叠形成的疏水内核较小,疏水性氨基酸残基被裸露于外部的亲水性氨基酸残基所包埋、大部分序列构成了亲水表面、形成亲水的蛋白颗粒。  4、利用目标DNA片段构建的DsRed2的原核表达载体pGEX4T-1-DsRed2,目的基因DsRed2正确插入到原核表达载体pGEX4T-1的GST标签基因的下游,目的基因DsRed2与GST标签基因形成无移码突变的可连续阅读的开放阅读框,两者构成GST-DsRed2融合基因。  5、DsRed2基因不仅在表达菌株BL21(DE3)中能够表达,而且在克隆菌株DH5α中也能够表达。在BL21(DE3)中RFP2的表达量,在1~5h范围内,随诱导时间的延长而迅速增加,此后增加不明显;诱导3h时,目的蛋白的积累量已非常充足。  6、RFP2在细胞中有一定的可溶性,但大部分RFP2以难溶性包涵体形式存在,且能正常显示出红色荧光。RFP2为单体蛋白,无需形成多聚体且无需特殊光源激发,在自然光下即可呈现出红色荧光。
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