目的:探讨艾片(左旋龙脑)、天然冰片(右旋龙脑)、冰片(合成龙脑)、苏合香、安息香五味开窍药的神经血管单元(NVU)保护作用及其相关机制,以阐释开窍药开窍醒神功效的科学内涵;同时比较五味开窍药的药效强弱,为临床组方选药提供参考。方法:(1)采用线栓法制备永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)大鼠模型,记录各组大鼠从麻醉到苏醒的时间,并参照Longa评分法对大鼠神经功能损伤进行评分。(2)采用干湿重法测定pMCAO模型大鼠脑含水量、脑指数及脑水肿率。(3)采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法对pMCAO模型大鼠脑组织进行染色观察脑组织梗死情况,并测计算脑梗死率。(4)采用苏木精-伊红(HE)染色法观察pMCAO模型大鼠缺血半暗带脑组织细胞形态,并计算神经元变性细胞指数(DCI)。(5)采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定pMCAO模型大鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。(6)采用实时定量荧光PCR(RT-PCR)法、免疫印迹法(WB)法、免疫组织化学法测定pMCAO大鼠模型缺血半暗带脑组织中Wnt3a、β连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、大肠腺瘤样息肉蛋白(APC)、紧密连接蛋白5(Claudin-5)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA及蛋白的表达。(7)采用透射电镜观察pMCAO大鼠缺血半暗带脑组织中神经元以及血脑屏障超微结构。结果:(1)三种冰片能显著延长模型大鼠麻醉后苏醒时间(P<0.01),苏合香与安息香对苏醒时间无明显影响;艾片与安息香能显著降低模型大鼠术后24 h的神经行为评分(P<0.05),天然冰片与冰片有降低行为评分的趋势。(2)艾片、冰片、苏合香、安息香能显著降低模型大鼠缺血侧脑含水量、Δ含水量、Δ脑指数(P<0.01);艾片、冰片、安息香能显著降低模型大鼠脑水肿率(P<0.01)。(3)TTC染色结果显示,造模后脑组织可见明显的苍白梗死区,开窍药对脑梗死有不同程度的改善作用,艾片、冰片、苏合香、安息香能显著降低模型大鼠脑梗死率(P<0.01)。(4)HE染色结果显示,造模后大鼠缺血半暗带脑组织出现明显病理学变化,表现为神经组织坏死、液化,形成筛网状病灶,与周围组织有较明显分界,五味开窍药可不同程度改善脑组织病理学变化。艾片、冰片、苏合香、安息香可显著降低模型大鼠缺血脑组织神经细胞DCI(P<0.01)。(5)五味开窍药均能显著升高模型大鼠血清中VEGF的含量,显著降低模型大鼠血清中TNF-α的含量(P<0.05或P<0.01),对NGF及IL-1β无明显影响。(6)总体来看,开窍药有升高pMCAO模型大鼠缺血半暗带脑组织中Wnt3a蛋白、β-catenin mRNA、Dsh1 mRNA、GSK-3βmRNA与蛋白、Claudin5 mRNA与蛋白、Bax mRNA与蛋白、Bcl-2 mRNA与蛋白表达的作用趋势,有降低Wnt3a mRNA、β-catenin蛋白、LEF1 mRNA、APC mRNA与蛋白、Caspase-3 mRNA与蛋白表达以及Bax与Bcl-2表达比值的作用趋势。(7)透射电镜结果显示,模型组大鼠缺血半暗带脑组织神经元的细胞核溶解、双层核膜结构不连贯、细胞浆内细胞器溶解消失,胞浆呈空泡状,毛细血管壁层次增厚,内皮细胞、基底膜和胶质细胞之间的突起之间的间隙增宽,而五味开窍药能不同程度改善模型大鼠脑组织神经元和BBB的超微结构。结论:五味开窍药有促进pMCAO模型大鼠神经功能恢复、降低脑含水量及脑梗死率、减轻神经细胞损伤的作用,可能是开窍药发挥“开窍醒神”功效的主要药效学基础。五味开窍药的药效作用强弱依次为艾片>冰片>安息香>苏合香>天然冰片,提示临床在选用开窍药组方治疗脑缺血相关疾病时首推艾片。开窍药通过调节Wnt/β-catenin信号通路、抑制细胞凋亡、促进微血管新生以及保护BBB而保护神经血管单元,这可能是其综合表达“开窍醒神”的主要生物学机制。五味开窍药的NVU保护机制聚类不同可能与开窍药的寒热药性差异有关。冰片、天然冰片的抑制细胞凋亡可能与其寒凉药性有关,而苏合香与安息香的促微血管新生及保护BBB可能与其温热药性有关。本研究以NVU为切入点探讨开窍药的脑保护作用及机制,研究思路具有中医药整体观特色,研究借助了RT-PCR、免疫印迹及免疫组化等分子生物学手段,并结合了透射电镜等光学成像技术,研究手段具有集成创新,研究结果提示艾片改善脑缺血药效最优,为临床有效合理使用开窍药提供了参考。