果皮色泽是果实的重要农艺性状,是果实品质的重要属性之一。花青苷是决定果实色泽的主要色素,对人类健康有益。因此,培育果实着色好、花青苷含量高的苹果品种是每个育种家的追求。芽变选种作为遗传育种的一种方式,优中选优,通过芽变选种,对现有苹果品种着色等品质和农艺性状进行有效改良。DNA甲基化修饰MYB1/10启动子,从而影响了MYB1/10基因的表达,进而调控了花青苷下游基因的转录,最终导致芽变色泽的不同。但是,DNA甲基化如何识别MYB1/10这一甲基化位点,来影响MYB1/10的表达,进而调控花青苷下游其它基因尚不清楚。因此,利用苹果色泽芽变突变体,研究DNA甲基化如何影响苹果MdMYB1启动子,来探讨苹果芽变形成机理,为苹果芽变育种提供理论支持。本研究选取‘长富2号’、‘烟富3号’和‘烟富8号’三个富士品种为研究对象,其中,‘烟富3号’苹果是‘长富2号’的红色芽变,‘烟富8号’是‘烟富3号’的红色芽变。本研究从三个‘富士’苹果花青苷含量、MdMYB1启动子甲基化水平、调控MdMYB1启动子甲基化的基因的挖掘及鉴定,并鉴定MdMYB1下游花青苷途径的转运蛋白等方面开展研究,主要结果如下:1.在‘长富2号’苹果中,果皮花青苷在摘袋后4-16天逐渐积累,在16天时达到峰值,最终形成红条纹。而花色素苷在‘烟富3号’和‘烟富8号’果皮中快速积累,‘烟富3号’最终呈现片红,而‘烟富8号’呈全红。果皮中花青苷含量在各个时期均是芽变高于其母本。对苹果花青苷主要调控基因MdMYB1表达量进行分析,结果发现,着色较较浅的品种(如:‘长富2号’)的转录水平略有增加,着色深的品种(如‘烟富3号’和‘烟富8号’)MdMYB1的转录水平在发育后期大幅增加。MdMYB1基因的差异表达是导致这三个‘富士’苹果品种着色差异的主要原因。2.对三个‘富士’苹果品种MdMYB1的cDNA和gDNA序列进行分析,结果表明,cDNA和gDNA序列上没有碱基的突变及错配,说明3个‘富士’苹果品种着色的差异不是由于MdMYB1基因的遗传变异导致的。通过检测三个‘富士’品种MdMYB1启动子甲基化水平,发现MdMYB1启动子的MR3区域在三个品种中表现出显著的差异;进一步分析表明,在三个品种在MR3区域CHH甲基化水平差异可能是导致三个‘富士’品种色泽差异的主要原因。3.利用酵母单杂交实验来验证MdAOG4s蛋白与MdMYB1的启动子结合,酵母单杂交结果发现,MdAOG4s可以结合MdMYB1启动子,进一步的酵母单杂交实验表明,MdAG04s只能结合MdMYB1启动子的p4段。利用ChIP-qPCR实验验证MdAOG4s与MdMYB1的启动子互作,结果显示,c3片段能够在35S::AG04s-GFP的愈伤中富集,证明MdAG04s能够体内结合MdMYB1启动子的c3片段。通过免疫共沉淀(Co-IP)实验来验证MdAG04s、MdDRM2s和MdRDM1的互作关系。结果显示,MdAG04-1能够与MdDRM2-1/2 和 MdRDM1 互作,MdAG04-2 能够与 MdDRM2-1/2 和 MdRDM1 互作,MdDRM2-1/2与MdRDM1互作。同时,利用Pull-down实验在体外实验也证明了MdAG04s、MdDRM2s 和 MdRDM1 的相互作用关系。结果说明 MdAG04s、MdDRM2s和MdRDM1能够两两互作形成蛋白复合体。在‘王林’和红肉愈伤组织中过表达MdAG04s、MdDRM2s能够上调MdMYB1/10启动子的甲基化水平。4.本研究进一步来验证MdAG04s能否结合发生甲基化的MR3区域。利用ChIP-qPCR实验,结果发现MdAG04s的确能够结合发生甲基化MR3区域。随后,RNAi干扰PolV中最大亚基MdNRPE1的表达,进一步的ChIP-qPCR实验表明,干扰MdNRPE1后MdAG04s对MR3区域的结合被抑制。上述结果表明,MdAG04s结合CHH甲基化区域需要lncRNAs的参与。5.本研究利用EMSA实验来验证MdAG04是否体外与MdMYB1启动子结合。EMSA实验表明,MdAG04s只结合c3片段上的probe2序列,并且不结合probe1、probe3、probe4。分段突变结果显示,MdAG04s 能够结合 2-m1、2-m2、2-m4 和 2-m5 4个探针,而不能结合2-m3。结果表明,完整的m3序列(GATATCAGAC)是MdAG04s结合MdMYB1启动子所必须的。进一步运用MdFLS(含有ATATCAGA序列)和MdGST(含有GATATCA序列)探针进行EMSA实验,结果显示,MdAG04s不能结合MdGST探针,能够结合MdFLS探针,即使它相当于GATATCAGAC少两个碱基。综上,MdAG04s能够特异结合ATATCAGA序列。ChIP-PCR结果显示,在沉默MdNRPE1后,并不影响MdAG04s对c3区域的结合。综上所述,MdAG04s可以通过ATATCAGA序列直接结合MdMYB1启动子。6.在苹果基因组鉴定到69个GST编码基因。通过RT-PCR筛选,确定MdGSTF6为参与花青苷途径的候选基因。同源系统发育树分析表明,苹果MdGFTF6是桃PpRiant、草莓FvRAP、葡萄VvGSTF12、拟南芥AtGSTF12的同源基因。氨基酸序列分析表明,MdGSTF6的序列与PpRiant、FvRAP、VvGSTF12的序列最为相似。其中,桃的PpRiant编码一个花青苷转运蛋白,既然MdGSTF6与PpRiant高度相似,那么MdGSTF6可以作为一个苹果花青苷转运蛋白候选蛋白。7.通过原生质体亚细胞定位以及膜胞浆蛋白分离定位,结果表明MdGSTF6定位在细胞的液泡膜上。转基因互补拟南芥突变体tt19,结果发现,在tt19中过表达MdGSTF6能够恢复其积累花青苷的表型。在苹果果皮中,利用病毒诱导的沉默实验证明,抑制MdGSTF6的表达能够影响果实花青苷的积累。利用RNAi实验,在‘嘎啦’组培苗中沉默MdGSTF6的表达,影响了花青苷积累,但不影响花青苷调控基因和结构基因的表达。综上,MdGSTF6基因编码一个花青苷转运蛋白,在花青苷积累中起重要作用。8.通过克隆MdGSTF6的启动子,以MdGSTF6的启动子序列为诱饵,进行酵母单杂交筛库实验。通过测序、blast,结果发现,MdMYB1可以作用于MdGSTF6的上游。随后利用酵母单杂交实验验证了这一结果。EMSA实验表明,MdMYB 1能够与MdGSTF6启动子上的MBS基序结合。ChIP-PCR实验表明,MdMYB1在体内结合MdMYB1的启动子。LUC报告实验证明,MdMYB1能够激活MdGSTF6的表达,并受到MBW复合体调控。GUS染色实验进行进一步说明MdMYB1能够激活MdGSTF6的启动子活性,上调MdGSTF6的表达。