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罗非鱼是全球养殖总量仅低于鲤鱼的水产养殖品种之一。它是许多发达国家和发展中国家人民的重要蛋白质来源。为了满足对鱼类的高需求,罗非鱼通常养殖密度较高,导致养殖罗非鱼疾病时常发生,对水产养殖业造成了重大打击。在水产养殖中,益生菌在抗病、提高免疫力、改善水质等方面的应用得到了很好的阐明。然而,在水产养殖中使用的益生菌很多并非来源于鱼体,因此,它们在水产动物上应用的效果相对较差。宿主相关的益生菌,即“最初从养殖水体或宿主的消化道中分离出来,以改善宿主的生长和健康的细菌”,被认为是水产养殖业的未来。在许多候选微生物中,益生芽孢杆菌由于具有孢子形成能力,使它们在恶劣环境条件下(耐热和更长的寿命)存活,此外,多数芽孢杆菌对鱼类没有致病性且无毒,并能产生广泛的抗菌物质,因此比其他益生菌更适合作为候选益生菌。因此,本论文从罗非鱼消化道中分离和鉴定芽孢杆菌,通过体外实验对其形态、生化和抑菌活性等进行研究,通过养殖实验,对其体内益生菌潜力进行了评估,研究了不同菌株对尼罗罗非鱼生长、消化酶和抗氧化酶能力、血清和粘液免疫、基因表达的影响及其对尼罗罗非鱼菌群和肠道形态的影响。同时,通过人工感染实验,对分离的芽孢杆菌抵御无乳链球菌和嗜水气单胞菌感染的能力进行了评价。结果显示,我们从尼罗罗非鱼的肠道成功分离到3株芽孢杆菌,分别为贝莱斯芽孢杆菌TPS3N(MK130897)、枯草芽孢杆菌TPS4(MK130899)和淀粉酶样芽孢杆菌TPS17(MK130898)。贝莱斯芽孢杆菌TPS3N和淀粉酶样芽孢杆菌TPS17表现为α-溶血,而枯草芽孢杆菌TPS4表现为γ-溶血。体外研究表明,三种芽孢杆菌在高温(80℃、90℃和100℃)下均具有较高的生存能力,对低p H值(1)和低胆盐浓度(0.5%)具有耐受性,同时具有较高的细胞表面疏水性和自凝集性,说明易于肠道定植。这三种芽孢杆菌可相互兼容,因此可以联合使用。这些菌株对庆大霉素、头孢氨苄、氨苄青霉素、头孢曲松钠、、卡那霉素、阿米卡星、盘尼西林、头孢哌酮钠、氯霉素、红霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星、克林霉素(除枯草芽孢杆菌TPS4)和呋喃唑酮(除淀粉酶样芽孢杆菌TPS17)是敏感的。抗菌鉴定结果表明,在3株分离菌中,TPS3N、TPS17对3种鱼类致病菌(无乳链球菌、嗜水气单胞菌、哈氏弧菌)均有较好的抗菌活性,而枯草杆菌TPS4仅对无乳链球菌有效。为了评估尼罗罗非鱼体内三种宿主相关芽孢杆菌的益生菌潜力,进行了为期四周的饲养试验。试验鱼被分为5个处理组,包括不含细菌的对照组CT组、含有贝莱斯芽孢杆菌TPS3N的V组,含有枯草芽孢杆菌TPS4的S组,含有淀粉酶样芽孢杆菌TPS17的为A组以及三株芽孢杆菌按照1:1:1混合投喂的CB组。试验结束时,芽孢杆菌处理组在终重(FW)、增重(WG)、比较生长率(SGR)、饲料转化率(FCR)等方面均有提高,其中CB组表现最佳。处理组与对照组比较,免疫球蛋白M(Ig M)、溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、消化酶(脂肪酶、胰蛋白酶)等指标均有提高。与对照组相比,V、S、A、CB组的GOT和MDA活性明显降低。生长相关基因GHR-1和IGF-1在投喂了芽孢杆菌的鱼的肝脏和头肾(HK)中均显著上调。同样,CB组诱导显著提高TNF-α,TLR-2,Ig M(除了在肝脏)和C-LYZ在所有组织的表达。随后用无乳链球菌进行的攻毒试验,CT、V、S、A和CB处理组的累积死亡率分别为60.0%、33.33%、26.67%、20.0%和13.33%。进一步研究了三种宿主相关芽孢杆菌对尼罗罗非鱼黏膜免疫、肠道形态、肠道消化酶活性、肠道菌群和抵御嗜水气单胞菌感染能力的影响。试验鱼被分为5个处理组,包括不含细菌的对照组CT组、含有贝莱斯芽孢杆菌TPS3N的V组,含有枯草芽孢杆菌TPS4的S组,含有淀粉酶样芽孢杆菌TPS17的为A组,三株芽孢杆菌1:1:1混合投喂表示CB组。饲养试验结束时,实验组的皮肤黏液和肠道免疫滴定度记录的一氧化氮(NO)(除了V组和S组的粘膜),免疫球蛋白M(Ig M)(除了V组肠),溶菌酶(LZM)和碱性磷酸酶(AKP)均显著高于对照组。肠道抗氧化酶(过氧化氢酶(CAT)(S组除外)和超氧化物歧化酶(SOD))活性在实验组较高。此外,补充芽孢杆菌的实验组肠道脂肪酶活性升高,与对照组相比,补充芽孢杆菌组肠道形态学参数(绒毛高度、绒毛宽度、杯状细胞计数(S组和A组除外)、肠道肌肉厚度均明显增强。肠道菌群研究表明,补充益生菌还会影响尼罗罗非鱼的肠道菌群组成。一般,在本研究中,变形杆菌门的丰度最高,其次是厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门。在属水平上,与对照组相比,补充芽孢杆菌组的致病菌葡萄球菌和气单胞菌的丰度降低。嗜水气单胞菌的攻毒试验表明,对照组、V组、S组、A组和CB组的死亡率分别为86.67%、50.00%、43.33%、63.33%和30.00%。综上所述,从尼罗罗非鱼肠道中分离出3种芽孢杆菌,体外研究表明,这3种芽孢杆菌可作为罗非鱼养殖的潜在益生菌。通过膳食补充的体内研究发现,三种芽孢杆菌单独或联合使用可以改善尼罗罗非鱼的生长、消化能力、血清和粘液免疫能力、肠道健康和微生物群,并能提高尼罗罗非鱼抵御无乳链球菌和嗜水气单胞菌感染的能力。综合以上结果,可以认为贝莱斯芽孢杆菌TPS3N、枯草芽孢杆菌TPS4和淀粉酶样芽孢杆菌TPS17是罗非鱼养殖的潜在益生菌,而三种益生菌混合使用的效果最佳。