论文部分内容阅读
目的建立紫外线B(UVB)对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的病理模型,探讨在UVB辐射下,扇贝多肽(PCF)抑制UVB诱导的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的作用机制。方法采用正交实验设计,以流式细胞仪PI染色法测定细胞凋亡率,采用45 mJ/cm2的UVB辐射体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞,确立凋亡的病理模型,实验分为六组:正常对照组、UVB模型组、UVB + 5.69 mM PCF组,UVB + 2.84 mM PCF组,UVB + 1.42 mM PCF组和UVB + 5.69 mM VitC组。首先研究PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞后氧化还原状态的影响,UVB辐射后测定细胞抗羟自由基、抗超氧阴离子的水平、黄嘌啉氧化酶(XOD)和NADPH氧化酶活力;以2,7-二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)为荧光探针,检测PCF对UVB照射后细胞内ROS生成的影响。其次,研究PCF对UVB诱导小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的线粒体通路和表面受体通路的影响,分别用Rhodamine 123和Fluo-3-AM荧光染色测定线粒体膜电位和细胞内游离钙的变化;免疫细胞化学检测细胞Bcl-xl和Bid基因蛋白的表达;流式细胞仪检测caspase-3的活性;western-blot检测线粒体细胞色素C(cytochrome c)的释放、FADD和caspase-8基因蛋白的表达;电镜分析PCF和caspase-8抑制剂(z-IETD-fmk)对UVB诱导的胸腺淋巴细胞凋亡的影响;RT-PCR检测Fas(CD95)mRNA的表达。最后,使用基因芯片技术分析PCF对UVB辐射后小鼠胸腺淋巴细胞基因谱的差异表达影响。Western-blot检测硫氧还蛋白(Trx)、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt/PKB)的活性,预先加入或不加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002检测细胞凋亡信号调节激酶Ⅰ(apoptosis signal regulating kinase-1,ASK1)、JNK的活性、DNA ladder和线粒体膜电位(?ψМ);免疫细胞化学检测细胞p53基因蛋白的表达;原位杂交检测细胞p38 mRNA、p21 mRNA的表达;RT-PCR检测c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达;结果正交实验结果表明,45 mJ/cm2的UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞后2 h为最佳凋亡模型;在1.42 mM~5.69 mM浓度范围内,PCF能提高抗羟自由基和抗超氧阴离子的水平,降低胸腺淋巴细胞中黄嘌啉氧化酶、NADPH氧化酶的活力和ROS的含量。PCF可调节线粒体通路和表面受体通路上凋亡相关分子的表达,稳定线粒体的膜电位,降低淋巴细胞内游离钙离子,使Bcl-xl蛋白表达升高而Bid蛋白表达降低;PCF抑制线粒体cytochrome c的释放,使caspase-3的活性降低;PCF可抑制表面受体通路上Fas mRNA、FADD和caspase-8基因蛋白的表达;当预先给予caspase-8抑制剂和PCF能够减轻UVB对细胞超微结构的损害。基因芯片结果显示,与模型组相比,PCF组有功能差异表达的基因共104个,其中上调基因56个,下调基因48个;western-blot结果提示,PCF能够提高小鼠胸腺淋巴细胞硫氧还蛋白的表达,激活AKT的活性,抑制ASK1-JNK/p38凋亡通路的活化。预先使用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002,DNA ladder片段增多,线粒体膜电位降低;此外,PCF可提高细胞周期相关基因p53蛋白的表达和p21 mRNA的表达;降低转录因子c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达。结论:PCF能够改善由UVB辐射诱导的细胞氧化损伤,从根本上降低活性氧自由基的产生,是较好的海洋类抗氧化剂;PCF能够抑制线粒体凋亡信号通路和膜表面受体凋亡信号通路;提高抗氧化蛋白、细胞生存相关基因,抑制ASK1-JNK/p38凋亡通路的活化,抑制转录因子的表达,PCF通过调节细胞氧化还原、凋亡、信号转导、细胞周期、转录调节等众多基因的表达,起到抗氧化、抗凋亡、抑制UVB对小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的作用。上述结果表明,PCF是海洋类抑制UVB辐射的优质防护剂。