论文部分内容阅读
背景:椎间盘退行性疾病(disc degenerative disease,DDD)是一类以椎间盘(intervertebral disc,IVD)髓核(nucleus pulposus,NP)退变为核心病理变化、以NP碎裂、IVD突出为主要病理结果,进而引起一系列临床症状的脊柱疾患,其人群发病率极高,严重影响中老年人的劳动能力和生活质量,已成为日益突出的社会健康问题。目前,针对DDD的治疗均以缓解和改善临床症状为目的,尚无修复退变碎裂的NP、重建IVD的生物力学功能的临床治疗手段。组织工程技术的发展为NP的再生修复展现出崭新的前景,日益受到广泛关注。目的:IVD在体内主要是发挥生物力学功能,承载着较高的应力负荷,其中NP更是承载了脊柱所受到的70%轴向应力负荷。因此组织工程髓核(tissue-engineered nucleus pulposus,TE-NP)在植入体内时应具有良好的力学性能和生物学功能,保证在较高的应力负荷下TE-NP可以维持其结构和功能,为NP组织提供再生模板,恢复IVD的生物力学功能,重建脊柱的生物力学。然而,目前TE-NP的生物力学性能的不足是限制TE-NP进一步发展的重要瓶颈问题之一。本研究旨在构建一种具有较强力学性能和生物活性的TE-NP,然后在此基础之上,研究不同强度轴向压应力对TE-NP内髓核细胞(NPCs)生物学功能的影响。方法:本课题在前期研究的基础之上,制备了一种由天然材料——氧化葡聚糖(oxidative dextran,ODex)、氨基化明胶(amino gelatin,MGel)以及合成材料——四臂聚乙二醇-丙烯酸酯(4-arm-poly-(ethylene glycol)-acrylate,4A-PEG-Acr)构成的、适用于NP修复的强化力学性能多层互穿多聚物网络(interpenetrating polymer network,IPN)水凝胶。本研究通过调整IPN水凝胶中4A-PEG-Acr的比例,检测孔径、孔隙率、力学性能、水合能力以及细胞相容性等理化性能,以优化筛选适用于TE-NP的性能最优的、仿生的IPN水凝胶,然后观察该IPN水凝胶内三维(three dimensional,3D)培养的NPCs增殖活性、生化成分含量、NP特异性基因和胞外基质(extracellular matrix,ECM)相关蛋白的表达。在此基础之上,将TE-NP置入前期自主研发的―智能化反馈调控组织轴向应力仿生施加及培养系统‖中,运用不同强度的动态轴向压应力加载于TE-NP以增强其生物学功能,观察不同强度的压应力对TE-NP的细胞增殖活性、ECM合成、细胞表型、合成代谢、分解代谢、炎症相关基因表达、细胞凋亡及细胞骨架的影响,探索轴向压应力对TE-NP生物学功能的效应―窗‖,寻找对TE-NP生物学功能发挥正向调控作用的轴向压应力的适宜强度。结果:(1)由4A-PEG-acr、ODex和MGel通过两步交联反应制成的IPN水凝胶是适用于NP组织工程的良好支架材料。当三者的成分比例为2:3:5时,该水凝胶具有仿生的3D结构、高孔径、高强度、高韧性、与NP类似的吸水膨胀能力以及良好的细胞相容性。接种于该水凝胶中的NPCs具有良好的增殖活力,并维持了天然的表型,具有良好的生物合成能力。(2)不同强度的轴向压应力对TE-NP的生物学功能产生了不同的影响。根据本研究发现,低强度的压应力(1%~10%)尤其是压缩量为1%的压应力可以有效地增强TE-NP的细胞增殖活性和合成代谢能力,减少了NPCs的分解代谢、炎症相关基因表达和凋亡,并维持细胞正常的类圆形结构;而高强度的压应力(15%-20%)对TE-NP的生物学功能起到了负性调节作用,导致了NPCs的分解代谢、炎症相关基因和凋亡相关基因表达的上调,合成代谢减少,波形蛋白的表达升高且细胞形态呈长梭形改变。全文结论:由4A-PEG-acr、ODex和MGel通过两步交联反应制成的IPN水凝胶是适用于NP组织工程的良好支架材料,当三者的成分比例为2:3:5时该水凝胶具有强化的力学性能和良好的细胞相容性,有利于承载一定强度的应力负荷。以该水凝胶为支架构建的TE-NP在低强度的应力作用(1-10%)尤其是压缩量为1%的低强度压应力作用下,细胞维持了天然的类圆形结构,内部细胞增殖活性和合成代谢能力明显增强,进一步增强了TE-NP的生物活性;然而,高强度的压应力作用(15%-20%)对TE-NP的生物学功能起到了负性调节的作用。本研究制备具有良好的力学性能和生物活性的TE-NP,并发现低强度压应力可以增强TE-NP的生物学功能,为其临床应用奠定了实验基础和提供了理论依据。