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细胞周期循环需要细胞周期因子依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)的顺序性活化。大小为27kd的细胞周期因子依赖性激酶抑制剂p27Kip1通过与CDK4-cyclin D和CDK2-cyclin E和/或cyclin A的相互作用,在整合细胞外信号与细胞周期调节元件间作用,调节细胞进出细胞周期、生长、分化、凋亡及肿瘤形成等过程中发挥关键用。临床研究发现p27Kip1在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达水平均下调,且与预后不良相关。因此,对p27Kip1的转录后表达调控的研究具有重要意义,并有可能发现治疗肿瘤的新靶点。目前已经发现,ELAV样RNA结合蛋白HuR对p27KiP1的翻译调节具有重要作用,但不同的研究的研究中HuR的作用却显著不同甚至截然相反。Millard等发现,胚胎致死异常视觉基因样RNA结合蛋白(embryonic lethal abnormal visual system, ELAV like RNA binding protein) HuR通过与p27Kip1 mRNA的5’UTR结合,刺激基底的和细胞周期依赖性的p27KiP1的翻译。但Kullmann等却报道,HuR仅在增殖期细胞而非静止期细胞中抑制内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)依赖性的p27KiP1的翻译。最近研究发现一个带有上游开放阅读框的p27Kipl mRNA同型体可能对P27Kip1表达的细胞周期依赖性调节发挥作用。更有研究报道在p27KiP1的5’UTR中存在核酸内切酶结合位点,因此提不p27Kip1 mRNA的稳定性可能也在p27Kip1的转录后表达调控中发挥作用。为了阐明细胞外信号是如何调节p27Kip1的表达的,尤其是如何调节p27Kipl mRNA的翻译和稳定性的,分析p27KiP1的转录后调控的不同机制,验证以上假设,我们通过以下几方面进行研究：1.在p27Kip1全长cDNA的基础上,采用5’及3’端cDNA尾快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获得p27Kip1 mRNA的各个同型体。2.采用双重荧光素酶报告检测系统(Dual Luciferase reporter assay, DLA)对p27Kipl mRNA 5’和3’端未翻译区(untranslated regions, UTR)中不同片段进行分析,从而鉴别出p27Kipl mRNA中的顺式作用元件。并采用real-time PCR检测相应的mRNA水平,从而判断报告系统表达的变化是由于翻译水平的改变还是由于mRNA的稳定性改变造成。3.采用蛋白-RNA交联法(protein-RNA crosslinking)对含有假定的顺式作用元件的p27Kip1 mRNA片段进行分析,从而鉴别出与这些片段结合的反式作用因子。4.通过siRNA干扰、免疫共沉淀及蔗糖梯度离心法等技术进一步证实内源性p27Kipl的表达同样受HuR的调节,且HuR是通过调节p27Kipl mRNA的稳定性而非通过调节p27KipI mRNA的翻译效率而发挥作用的。我们的研究发现HuR调节P27Kip1基因表达的不同机制,即HuR通过调节P27Kip1 mRNA的稳定性,从而调节p27Kipl基因的转录后表达。并进一步确定HuR蛋白是通过与人和鼠的p27Kipl mRNAs的5’和3’未翻译区中的多个U-rich结构域结合发挥作用的。这种结合在体内外均发生,且通过增加p27Kip1 mRNA的稳定性并促进其聚集。敲除p27Kipl mRNA中HuR的结合位点或小RNA干扰降低HuR水平都可以降低p27Kip1 mRNA的稳定性并减少其聚集。鉴于CDK抑制剂p27Kip1是细胞周期循环调控中的重要负性调节因子,其表达的上调可能减缓甚至阻止细胞顺利通过G1/S期转换,这是目前肿瘤治疗中的重要调控靶点之一。而根据目前的肿瘤靶向治疗研究的经验,对促进或抑制体内两分子的结合远较直接调控某分子的表达水平容易实现。因此,基于本研究发现的HuR结合并增加p27Kipl mRNA的稳定性并促进其聚集及表达的机制,我们可以通过筛选能促进体内HuR蛋白与p27Kipl mRNA结合的小分子化合物等方法,提高HuR与p27Kipl mRNA的结合并促进其表达,导致肿瘤细胞脱离细胞周期循环进入停滞期,这可以作为基础研究向临床肿瘤治疗研究转化的可能途径。此外,我们的研究还进一步发现,全长p27Kipl mRNA的5’未翻译区内的CT重复片段与一大小为41kd的蛋白结合并抑制p27Kipl的表达。该CT-rich域及3’UTR中的diffuse片段可以在翻译水平调节p27KiP1的表达。该研究是第一次证实HuR依赖性mRNA稳定性和HuR非依赖性的mRNA翻译在mRNA的转录后表达调控中均发挥关键作用。