兽疫链球菌透明质酸代谢途径中基因功能研究

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兽疫链球菌是工业上生产透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的主要菌株,但是兽疫链球菌中HA合成途径中基因的功能还没有得到系统的研究。目前,几株兽疫链球菌全基因组序列的公布及HA生物合成途径的阐述,为HA合成途径中基因的功能研究提供了理论基础。本论文以兽疫链球菌ATCC39920为研究对象,主要研究结果如下:  (1)通过BLAST发现兽疫链球菌HA合成途径中所有基因均存在且通过RT-PCR分析发现11个基因都得到表达。分析发现,均有两个不同的基因编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸变位酶和双功能酶(乙酰基转移酶和焦磷酸化酶),编码其他酶的基因只有一个;在has操纵子上有5个连续排列的基因,包括hasA、hasB、hasC1、hasD、hasE,其余基因均在远离has操纵子的位置。  (2)对编码葡萄糖-6-磷酸变位酶的两个基因pgm、pgmA功能的研究。通过表型和发酵分析发现,与野生型相比,Δpgm长势相对较快,ΔpgmΔpgmA长势相对较弱,且ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA菌落与野生型相比菌落较小,没有粘性荚膜,发酵分析中也检测不到HA;进一步对Pgm及PgmA进行体外表达、纯化及酶活检测,发现PgmA对底物葡萄糖-1-磷酸的特异性更强;体内酶活分析发现,Δpgm、ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA的PGM酶活分别比野生型菌株降低了38.1%、69.6%、84.2%。以上结果表明,Pgm和PgmA在兽疫链球菌体内均发挥葡萄糖-6-磷酸变位酶作用,且pgmA对HA的生物合成起着更重要的作用。  (3)对编码葡萄糖胺-6-磷酸合成酶基因glmS功能的研究。利用基因插入失活的方法筛选得到ΔglmS,且ΔglmS在不添加葡萄糖胺(GlcN)的THY培养基中不能生长;进一步研究GlcN的浓度对ΔglmS生长的影响时发现,当GlcN添加浓度为1 mg/mL时,ΔglmS的长势与野生型菌株差不多。以上结果表明,glmS是兽疫链球菌中编码葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的基因,而且可以作为一种筛选标记基因。  (4)通过表型和发酵分析发现,与HA合成相关基因的缺失,对兽疫链球菌ATCC39920的生长及HA的生物合成有不同的影响;与细胞壁合成相关的Glc-1-P、UDP-Glc和UDP-GlcNAc合成受阻时,不仅HA合成受阻,菌体细胞壁也不能正常合成,随之会导致菌体不能正常生长。
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