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目的:运用分子生物学等方法与技术,探讨脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织呼吸链复合物活性与相关信号通路分子表达变化,同时观察四君子汤对其干预的影响,旨为“脾主运化”理论的脑中枢可能机制,以及“益气健脾”法的生物学基础提供实验依据。材料与方法:1.动物模型复制与成模评价:健康SPF级Wistar雄性大鼠60只,以随机数字法分为正常组、模型组、四君子汤治疗组。分组:随机分为正常组,脾气虚证模型组,四君子汤治疗组。模型复制:依据文献,选用中医病因复合造模方法,即饮食不节与劳倦过度法。饮食不节模型建立:即模型组3天为一循环,先饱食1天,再禁食2天,自由饮水;劳倦过度:每日游泳至力竭(至大鼠没入水中无法上浮),水温35~37℃,连续15天。后两组动物按上述制模方法处理,连续15天,正常组不加任何刺激,正常饲养。第十六天,依据脾气虚模型评价标准,大鼠复合标准后即为成功造膜。根据文献脾气虚证评定标准:主症:(1)神疲、倦怠;(2)肢体乏力;次症:(3)体质量下降;(4)食量减少;(5)体温下降或略有降低;(6)便软或溏;动物同时满足两个主症及两个次症,判断脾气虚模型造膜成功。2.四君子汤治疗方法与时间:选用湖北广仁药业有限公司生产四君子丸(批号:国药准字Z42021149),清水溶解后常温保存。模型成功后次日进行治疗,治疗组大鼠以10g/Kg体重(相当于生药2g)2ml进行灌胃,模型组灌服等容积生理盐水,每日2次共治疗2周,正常组常规喂养。3.脾气虚证模型大鼠证候的量化方法:实验结束后禁食不禁水12h按正常组、模型和治疗组序轮流进行核心指标检测。运用旷场实验和“抓力”实验方法分别对模型大鼠“神疲、倦怠”“四肢乏力”等证候进行客观性量化;运用代谢笼收集24h尿液、粪便,并运用干燥法测定大便含水率;称重法测量体重、饮食量、饮水量等变化。运用电子体温计,插入直肠2厘米,测定大鼠体温。4.胃肠运动推进率检测方法:在行为学检测结束后,用10%水合氯醛行腹腔麻醉后,经胃管注入1.0ml炭粉阿拉伯胶混悬液,18min后手术暴露胃与小肠,用丈量法检测胃肠碳末推进速度,并换算出推进率。5.海马CA3区取材方法:麻醉状态下手术取出大脑,参考文献,进行大鼠海马3区解剖定位后切除、固定,分别进行呼吸链复合物活性、蛋白、基因检测;同时,取出海马CA3区组织进行2.5%戊二醛和多聚甲醛试剂处理保存,分别留作透射电镜和光镜检测。6.各指标检测方法:采用采用Western-Blot法和RT-PCR法检测大鼠海马GLUT3的蛋白和m RNA表达;采用ELISA法检测大鼠海马组织VIPc AMPAMPK的含量;比色法测定海马线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性,实时定量PCR检测PKA基因表达,Western-Blot法检测ATP合酶的蛋白表达,运用免疫组化法检测VIP2受体表达。7.数据处理数据均以_X±S表示,采用SPSS13.0软件对数据进行处理,主要采用ANOVA进行组间比较。结果:1.四君子汤对脾气虚证模型大鼠行为学影响:与正常组比较,模型组体重(p<0.05)、饮食量明显下降(p<0.05);双前肢抓力降低(p<0.05),旷场实验中运动距离和运动平均速度明显减少和减慢(p<0.05);垂直站立次数显著减少(p<0.05),旷场中心滞留时间明显延长(p<0.01)。与模型组比较,治疗组大鼠上述各项观察指标均明显得到改善,数据统计处理显示出显著性差异(p<0.05)。胃肠碳末推进率结果显示,模型组明显减慢(p<0.01),药物干预后得到纠正(p<0.05)。2.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区形态学影响:透射电镜结果显示,正常组线粒体圆形或卵圆形,包膜清楚,神经细胞外膜平滑;与正常组比较,模型组大鼠海马CA3区神经元线粒体肿胀,并出现空泡化;治疗组线粒体形态无明显改变,无空泡显现,神经细胞外膜平滑。3.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区组织VIP含量及受体表达影响:与正常组比较,模型组大鼠海马CA3区组织VIP含量及其VIP受体表达光密度值均出现明显下降和下调(p<0.01);与模型组比较,治疗组VIP含量及其受体表达均升高和上调(p<0.01)。4.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区细胞膜GLUT3表达影响:葡萄糖转运体3(GLUT3)多分布于中枢神经细胞膜,是细胞膜外葡萄糖分子跨膜转运至细胞内关键性蛋白。实验结果显示:与正常组比较,模型组大鼠海马CA3区细胞膜GLUT3m RNA的表达下调(p<0.01),GLUT3蛋白表达减少(p<0.01);与模型组比较治疗组GLUT3m RNA表达上调(p<0.01):GLUT3蛋白表达则上调(p<0.01)。5.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区组织呼吸链复合物活性影响:能量代谢需要线粒体呼吸链酶由4个复合物,因此检测四个复合物活性可以检测能量生成的效率,通过分别检测各个复合物活性结果显示:与正常组比较,模型组大鼠复合物Ⅰ活性下降(p<0.01)、复合物Ⅲ活性下降(p<0.01)、复合物Ⅳ活性下降(p<0.01);与模型组比较,治疗组复合物Ⅰ明显升高(p<0.01)、复合物Ⅲ明显升高(p<0.01)、复合物Ⅳ活性明显升高(p<0.01);复合物Ⅱ活性各组间没有显著性差异。6.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区组织ATP合酶表达影响:通过对ATP合酶免疫印迹的光密度积分分析结果显示,与正常组比较,模型组ATP合酶蛋白表达下调(P<0.01);与模型组比较,治疗组表达较模型组上调(P<0.01)。7.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区c AMP-PKA-AMPK表达影响:实验结果表明,与正常组比较,模型组大鼠海马3区组织c AMP含量明显减少(p<0.01),与模型组比较,治疗组c AMP含量增多(p<0.01);通过对PKA m RNA表达结果显示,与正常组比较,气虚大鼠海马组织PKAm RNA表达下调(p<0.01),与模型组比较,治疗组的PKAm RNA表达显著上调(p<0.01);通过对AMPK含量结果分析,海马3区组织AMPK检测结果表明,与正常组比较,模型组组织AMPK含量明显增加(p<0.01),与模型组比较,治疗组MAPK含量减少(p<0.01),并且与正常组已无显著性差异。结论:1.脾气虚证模型大鼠旷场试验中垂直站立次数减少、场中间区滞留时间延长;运动总距离减少和速度减慢,双前肢抓力下降;四君子汤干预后能够将其逆转。2.脾气虚证模型大鼠海马CA3区神经元线粒体肿胀,出现空泡化改变,四君子汤能够使其逆转。3.脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织VIP含量减少,其受体表达下调,四君子汤干预后能够降低VIP水平、下调其受体表达。4.脾气虚证模型大鼠海马CA3区细胞膜GLUT3的表达下调,四君子汤干预能够使其上调。5.脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性以及ATP合酶蛋白表达下降;四君子汤能够恢复其活性。6.脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织c AMP-PKA–AMPK信号分子含量及表达均减少和下调,四君子汤干预后可使其逆转。