四君子汤介导cAMP-AMPK通路对脾气虚证大鼠海马呼吸链酶活性影响研究

来源 :辽宁中医药大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:shijianwu2003
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:运用分子生物学等方法与技术,探讨脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织呼吸链复合物活性与相关信号通路分子表达变化,同时观察四君子汤对其干预的影响,旨为“脾主运化”理论的脑中枢可能机制,以及“益气健脾”法的生物学基础提供实验依据。材料与方法:1.动物模型复制与成模评价:健康SPF级Wistar雄性大鼠60只,以随机数字法分为正常组、模型组、四君子汤治疗组。分组:随机分为正常组,脾气虚证模型组,四君子汤治疗组。模型复制:依据文献,选用中医病因复合造模方法,即饮食不节与劳倦过度法。饮食不节模型建立:即模型组3天为一循环,先饱食1天,再禁食2天,自由饮水;劳倦过度:每日游泳至力竭(至大鼠没入水中无法上浮),水温35~37℃,连续15天。后两组动物按上述制模方法处理,连续15天,正常组不加任何刺激,正常饲养。第十六天,依据脾气虚模型评价标准,大鼠复合标准后即为成功造膜。根据文献脾气虚证评定标准:主症:(1)神疲、倦怠;(2)肢体乏力;次症:(3)体质量下降;(4)食量减少;(5)体温下降或略有降低;(6)便软或溏;动物同时满足两个主症及两个次症,判断脾气虚模型造膜成功。2.四君子汤治疗方法与时间:选用湖北广仁药业有限公司生产四君子丸(批号:国药准字Z42021149),清水溶解后常温保存。模型成功后次日进行治疗,治疗组大鼠以10g/Kg体重(相当于生药2g)2ml进行灌胃,模型组灌服等容积生理盐水,每日2次共治疗2周,正常组常规喂养。3.脾气虚证模型大鼠证候的量化方法:实验结束后禁食不禁水12h按正常组、模型和治疗组序轮流进行核心指标检测。运用旷场实验和“抓力”实验方法分别对模型大鼠“神疲、倦怠”“四肢乏力”等证候进行客观性量化;运用代谢笼收集24h尿液、粪便,并运用干燥法测定大便含水率;称重法测量体重、饮食量、饮水量等变化。运用电子体温计,插入直肠2厘米,测定大鼠体温。4.胃肠运动推进率检测方法:在行为学检测结束后,用10%水合氯醛行腹腔麻醉后,经胃管注入1.0ml炭粉阿拉伯胶混悬液,18min后手术暴露胃与小肠,用丈量法检测胃肠碳末推进速度,并换算出推进率。5.海马CA3区取材方法:麻醉状态下手术取出大脑,参考文献,进行大鼠海马3区解剖定位后切除、固定,分别进行呼吸链复合物活性、蛋白、基因检测;同时,取出海马CA3区组织进行2.5%戊二醛和多聚甲醛试剂处理保存,分别留作透射电镜和光镜检测。6.各指标检测方法:采用采用Western-Blot法和RT-PCR法检测大鼠海马GLUT3的蛋白和m RNA表达;采用ELISA法检测大鼠海马组织VIPc AMPAMPK的含量;比色法测定海马线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性,实时定量PCR检测PKA基因表达,Western-Blot法检测ATP合酶的蛋白表达,运用免疫组化法检测VIP2受体表达。7.数据处理数据均以_X±S表示,采用SPSS13.0软件对数据进行处理,主要采用ANOVA进行组间比较。结果:1.四君子汤对脾气虚证模型大鼠行为学影响:与正常组比较,模型组体重(p<0.05)、饮食量明显下降(p<0.05);双前肢抓力降低(p<0.05),旷场实验中运动距离和运动平均速度明显减少和减慢(p<0.05);垂直站立次数显著减少(p<0.05),旷场中心滞留时间明显延长(p<0.01)。与模型组比较,治疗组大鼠上述各项观察指标均明显得到改善,数据统计处理显示出显著性差异(p<0.05)。胃肠碳末推进率结果显示,模型组明显减慢(p<0.01),药物干预后得到纠正(p<0.05)。2.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区形态学影响:透射电镜结果显示,正常组线粒体圆形或卵圆形,包膜清楚,神经细胞外膜平滑;与正常组比较,模型组大鼠海马CA3区神经元线粒体肿胀,并出现空泡化;治疗组线粒体形态无明显改变,无空泡显现,神经细胞外膜平滑。3.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区组织VIP含量及受体表达影响:与正常组比较,模型组大鼠海马CA3区组织VIP含量及其VIP受体表达光密度值均出现明显下降和下调(p<0.01);与模型组比较,治疗组VIP含量及其受体表达均升高和上调(p<0.01)。4.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区细胞膜GLUT3表达影响:葡萄糖转运体3(GLUT3)多分布于中枢神经细胞膜,是细胞膜外葡萄糖分子跨膜转运至细胞内关键性蛋白。实验结果显示:与正常组比较,模型组大鼠海马CA3区细胞膜GLUT3m RNA的表达下调(p<0.01),GLUT3蛋白表达减少(p<0.01);与模型组比较治疗组GLUT3m RNA表达上调(p<0.01):GLUT3蛋白表达则上调(p<0.01)。5.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区组织呼吸链复合物活性影响:能量代谢需要线粒体呼吸链酶由4个复合物,因此检测四个复合物活性可以检测能量生成的效率,通过分别检测各个复合物活性结果显示:与正常组比较,模型组大鼠复合物Ⅰ活性下降(p<0.01)、复合物Ⅲ活性下降(p<0.01)、复合物Ⅳ活性下降(p<0.01);与模型组比较,治疗组复合物Ⅰ明显升高(p<0.01)、复合物Ⅲ明显升高(p<0.01)、复合物Ⅳ活性明显升高(p<0.01);复合物Ⅱ活性各组间没有显著性差异。6.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区组织ATP合酶表达影响:通过对ATP合酶免疫印迹的光密度积分分析结果显示,与正常组比较,模型组ATP合酶蛋白表达下调(P<0.01);与模型组比较,治疗组表达较模型组上调(P<0.01)。7.四君子汤对脾气虚证大鼠海马CA3区c AMP-PKA-AMPK表达影响:实验结果表明,与正常组比较,模型组大鼠海马3区组织c AMP含量明显减少(p<0.01),与模型组比较,治疗组c AMP含量增多(p<0.01);通过对PKA m RNA表达结果显示,与正常组比较,气虚大鼠海马组织PKAm RNA表达下调(p<0.01),与模型组比较,治疗组的PKAm RNA表达显著上调(p<0.01);通过对AMPK含量结果分析,海马3区组织AMPK检测结果表明,与正常组比较,模型组组织AMPK含量明显增加(p<0.01),与模型组比较,治疗组MAPK含量减少(p<0.01),并且与正常组已无显著性差异。结论:1.脾气虚证模型大鼠旷场试验中垂直站立次数减少、场中间区滞留时间延长;运动总距离减少和速度减慢,双前肢抓力下降;四君子汤干预后能够将其逆转。2.脾气虚证模型大鼠海马CA3区神经元线粒体肿胀,出现空泡化改变,四君子汤能够使其逆转。3.脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织VIP含量减少,其受体表达下调,四君子汤干预后能够降低VIP水平、下调其受体表达。4.脾气虚证模型大鼠海马CA3区细胞膜GLUT3的表达下调,四君子汤干预能够使其上调。5.脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性以及ATP合酶蛋白表达下降;四君子汤能够恢复其活性。6.脾气虚证模型大鼠海马CA3区组织c AMP-PKA–AMPK信号分子含量及表达均减少和下调,四君子汤干预后可使其逆转。
其他文献
美发现胰腺癌突变基因美国医学专家最近发现了一种癌症突变基因,这种基因能够通过父母遗传给下一代,引发胰腺癌、恶性黑瘤等一系列癌症。研究人员认为,这种突变基因的发现有助于
上帝挑选了人类的灵魂,赋予特殊的使命,赠其纯洁白衣。从此,凡间白衣天使横空出世。
期刊
预浸料制备工艺上的关键是通过解决熔融树脂的高黏度从而实现增强纤维与树脂间的界面结合能力。文中主要在树脂研究方面,通过添加5种比例的聚丙烯(PP)分别对高密度聚乙烯和线
现如今,伴随社会经济的不断发展与现代人婚恋观的变化,离婚现象越来越普遍,而由此则直接造成了离异家庭子女的增多。这些孩子因家庭中母亲或父亲角色的缺失,往往能会形成比较
<正>舞台美术是戏剧综合艺术创造的重要组成部分。随着以影像艺术为主流的"读图时代"的到来,以及相关舞台科技手段的不断丰富与发展,舞台美术在现代戏剧舞台上空前辉煌,在戏
招标组织形式可分为业主自行招标和委托招标代理机构招标两种:自行招标是指招标人自身具有编制招标文件和组织评标能力,经过核准和备案同意后可以自行办理招标;委托招标是由
番茄红素是抗氧化性强的天然类胡萝卜素,因其特殊的生物学特性,成为保健食品研究的热点。现对番茄红素的理化性质、保健功能及目前主要的制取方法作一综述,并对番茄红素开发应用