论文部分内容阅读
金龟子幼虫(蛴螬)是一类世界性的重要地下害虫,由于这类害虫为害植物地下部分,具有一定的隐蔽性,而且分布广泛,为害植物种类多,对农林生产造成了极为严重的损失。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)HBF-1菌株含有cry8Ca基因,产生的杀虫晶体蛋白对丽金龟科的黄褐丽金龟(Anomola exoleta)和铜绿丽金龟(A. corpulenta)具有很高的杀虫活性,目前已经将cry8Ca基因转化到烟草中,获得了转基因烟草植株。本项研究采用RNA斑点分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)测定法检测了cry8Ca基因在T1代转基因烟草中的表达,并采用生物学方法评价了T1代转基因烟草抗蛴螬的活性,建立了cry8Ca基因在烟草中表达的检测方法及抗蛴螬活性的生物测定体系,为今后研究评价抗蛴螬转基因植物提供了依据。本项研究对供试的110株T1代转cry8Ca基因烟草进行DNA-PCR检测,31株转pSmCN载体的烟草植株为阳性。采用随机引物法,通过地高辛标记目的DNA片段制备探针,提取植株的RNA,进行RNA斑点杂交,结果表明外源杀虫蛋白基因已经转入烟草中,并在烟草植株中遗传表达。酶联免疫吸附分析(ELISA)测定法广泛应用于转基因植物表达的杀虫蛋白的检测。本项研究采用过碘酸钠法,将纯化的Cry8Ca杀虫蛋白的多克隆抗体用辣根过氧化物酶标记,获得酶标抗体结合物,经过对各反应条件的优化,确定了双抗夹心ELISA方法检测烟草中Cry8Ca杀虫蛋白的最适体系:多克隆抗体浓度为1:3200,酶标结合物浓度为1:400,pH 9.6碳酸缓冲液提取,pH 7.4磷酸缓冲液包被,0.5%明胶-PBST封闭,TMB底物作用15 min。采用该检测体系检测T1代转基因烟草植株根部Cry8Ca蛋白的表达,结果表明,Cry8C蛋白含量最高可达14.461μg/g鲜重,占总蛋白量的0.057%。在组成型表达载体(pSmCN)的烟草植株中,不同的部位蛋白表达量不同,营养器官的含量高于生殖器官,根部的蛋白表达量显著高于茎基部和叶部。通过室内饲养研究,采用天然饲料饲喂铜绿丽和黄褐丽金龟的成虫和幼虫,明确了室内铜绿丽金龟种群完成一个生活史平均需要272.3d,比田间种群缩短约103.8d,。黄褐丽金龟种群在室内完成一个生活史平均需要230天。确定在壤土中接入金龟子的卵为转基因烟草对蛴螬抗虫性测定的最佳条件。将烟草地下根部受害程度分别设立五个危害等级,通过危害等级的评定,计算出危害指数。黄褐丽金龟和铜绿丽金龟幼虫对供试的T1代阳性转pSmCN载体烟草植株的危害率分别为61.1%和66.7%,危害指数分别为20.8和23.6;转pBI空载体对照烟草植株的危害率均为100%,危害指数分别为70.8和65.3。金龟子幼虫取食后,转基因烟草的各项生物学性状增长率明显高于对照植株。因此,T1代转cry8Ca基因烟草植株有较好的抗丽金龟科幼虫的活性。